三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(35)

关于淘汰肝炎表面抗原单扩散法和对流电泳法

淘汰乙型肝炎表面抗原对流免疫电泳法、单扩散法的理由及替代方法

　　乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)系1963年Blumberg在研牡究人血清中β一脂蛋白的同种异型抗体时，偶尔在一个澳大利亚土著人血清中发现的一种抗原，故称之为澳大利亚抗原，简称澳抗(Au)。1967年以后，人们发现澳抗与血型关系不大，而与肝炎相关，故改称肝炎相关抗原(Hepatitis Associated Antigen，简称HAA)。70年代，肝炎被区分出甲型与乙型。人们了解到HAA是乙肝表面抗原。世界卫生组织(WHO)则於1977年正式将其命名为Hepatitis B Surface Antigen，简称HBsAg。

　　60年代末，国际上采用单扩散方法(1D)测定HAA。抗体封与抗原可在琼脂扩散板中形成肉眼可见的沉淀线。这种方法甜简便易行，特异性强。但抗体的供应和保存困难，试剂难于标准化，各实验室之间可比性差，且灵敏度很低，只达到1—10万ng／ml。这是最初的乙肝表面抗原检验方法，并很快被淘汰。

　　取而代之的是对流免疫电泳法(CIEP)。该法是在琼脂双扩散法的基础上，利用在通电的琼脂中，pH8．0的条件下，使带负电荷的抗原从负极向正极泳动。抗体则因其分子量大，以致使电渗作用占据优势而由正极向负极泳动。抗原、抗体相向运动而相遇，在扩散板中形成肉眼可见的沉淀线。由于电场的作用，减少了检验的时间，检测的灵敏度也较单扩散法大为提高，可检出1000—10000ng／ml。但该方法灵敏度仍不理想，试剂难于标准化，以后也被淘汰。

　　70年代初期，反向血凝试剂(RPHA)问世。反向血凝法HBsAg试剂盒，是以动物的红细胞或人红细胞为载体，将抗体致敏红细胞，利用抗原与抗体特异结合及红细胞的放大作用，产生肉眼可见的凝集反应。这种方法简便，不需什么仪器和设备，灵敏度较对流免疫电泳法提高了约10—100倍，检出水平达20—100ng／ml。但由于非特异性凝集反应会造成假阳性，限制了该法灵敏度的进一步提高。凝集模式的不清晰及肉眼判读存在的个体主观差异，也造成各实验室之间可比性差。因之，反向血凝法被以后出现的放免法逐步取代。

　　放免法(RIA)是利用放射性同位素标记在抗体上，使其与HBsAg结合，洗去未结合部分，用г计数器测定同位素的CPM值。这种方法，可检出样本中HBsAg的含量可低达0．1—1．0ng／m1水平，标准化程度也很高。但该法因使用同位素而带来一系列问题：实验室需特殊防护，要有昂贵设备及仪器，同位素半衰期短造成试剂盒有效期短，且价格昂贵，运输困难。由于这种种因素，使该法难于广泛使用。

　　70年代未期，以美国Abbott公司为代表，采用珠式酶免试剂盒检验HBsAg，开始了酶免法(EIA)取代放免法的阶段。酶免法利用聚苯乙烯珠(或板)作为固相载体，吸附抗一HBS，抗体，检验样品中HBsAg，使用酶标记抗体取代同位素芝拆记抗体，酶标抗体结合待检样品中HBsAg。洗去未结合的标抗体，加入酶的底物，使之显色，根据颜色深浅，相应反映出样本中HBsAg的含量。该法可肉眼判读，也可用酶标仪测定。此方法属半定量检验方法，灵敏度接近放免法。该法克服了放免法的昂贵仪器、设备等条件限制，且灵敏度达到0．5一2ng／m1水平，试剂标准化程度高。尤其是1985年美国Ab-bott公司酶免法(珠式)单抗HBsAg试剂推出后，该项检验试剂的标准化程度更为提高，各实验室之间的结果更具可比性。酶免法遂取代放免法，为临床实验室广泛采用。

　　在国外乙肝诊断试剂迅速发展的同时，国内乙肝诊断试知也飞跃发展。国内外乙肝HBsAg试剂进展详见表1。

　　表1　国内外HBsAg试剂进展

　　从表1中可以看出，国内HbsAg试齐与国外同类产品相比，在生产年代和灵敏度方面存在着一定的差距。70年代国外(除一些第三世界国家外)单扩散法和对流免疫电泳法就已被反向血凝法所取代。国内则在进入80年代后才逐步完成这一过程。80年代国外除少数一些地区外，大部分已采用EIA和RIA法而淘汰了RPHA法，国内则在90年才逐步开始这一过程。

　　淘汰单扩散法和对流电泳法的原因主要在于此二法灵敏度太差，很难满足临床诊断和治疗的要求。

　　反向血凝法操作简便，2小时即可出结果，不需要特殊仪器和设备，尤其是血站过筛献血员，带上一个水浴箱，可随时随地开展检验，便于推广。而且价廉，适合国情，临床医师习惯于报阴、阳性结果，又报滴度的作法以了解病人病情。所以，至今RPHA法在国内仍占据主要地位。但RPHA法的严重缺点是国内使用的该法灵敏度不高，而作为传染病诊断的试剂，关键是不能漏检，此点在血站过筛献血员时尤为重要。1989年，卫生部临床检验中心在全国血站系统开展乙肝检验质控工作的初期就发现，造成HBsAg检验漏检的主要原因是血站过筛献血员时采用RPHA方法。卫生部临床检验中心于1989年制定的检验HBsAg的临界值标准为5ng／m1，国内目前RPHA试剂最灵敏的只能检出20—40ng／ml水平，大部分是处于80—160ng／ml，不符合要求。此外，HBsAg滴度的变化并不完全反映病人病情和病程。这就是卫生部部长令。不推荐RPHA法为检验HBsAg的替代试验的原因。酶免法(EIA)具有相当高的试剂标准化程度，结果具有可比性，且灵敏度接近RIA法，又不需要昂贵的仪器和设备，所以国外普遍采用EIA法进行HBsAg检验。根据英国国家质控中心的报告(表2)，参加英国乙肝质控的不同国家和地区的医院，检验HBsAg的方法，由87年至92年，RPHA法从46％下降7．8％；EIA法从38．7％上升至90．2％；RIA法从13．8％下降至1．2％。1992年EIA法在国际市场上占据90．2％的绝对优势。由此可了解国际上检验HBsAg的方法学发展的总体趋势。

　　表2　参加英国乙肝质控的医院检验HBsAg，采用的方法统计

　　国内EIA法使用的情况是这样的。在1988年，在卫生部临床检验中心在全国开展乙肝检验的质控工作的初期，EIA-HBsAg试剂一般处于5—20ng／m1水平，最差的甚至只能检出50ng／m1。而且结果的可比性很差，不同厂家试剂盒检出结果符合率很差，同一试剂盒不同批间的差异也极大。当时国内只有少数大医院，对少量的病例使用EIA法进行检验。1989年，卫生部临床检验中心对试剂生产单位和临床实验室提出夏一个统一的质量标准，即HBsAg临界值5ng／ml。以质量为先导，生产进入标准化阶段，使国内EIA——HBsAg试剂质量有较快的提高。1991，年卫生部临床检验中心，在对HBsAg试剂进行每年一次的常规评价中，发现19个国内生产厂中有15个的HBsAg试剂与美国Abbott公司EIA—HBsAg试剂具有95％以上的相对符合率，说明国产EIA—HBsAg试剂已有长足的进步，目前已具有相当高的水平。这就为EIA-HBsag法取代RPHA-HBsAg法提供了条件。进入90年代，国内约有10％的医院和血站完全用EIA-HBsAg取代RPHA进行检验病人和过筛献血员。尽管这个比例还很小，但比1988年全国只有少数几家大医院部分样本采用EIA检验和1989年全国没有一家血站采用EIA过筛献血员来说，有了一定的进步。

　　酶免试剂从常规的夹心法(二步法)向快速法(一步法)发展，采用预包被技术和待测血清与酶标抗体同时一起加入微孔板中进行反应，变二步为一步的作法，简化了操作，缩短了时间，深受临床实验室欢迎。

　　酶免法技术，目前国内外还在酶标抗体技术和载体材料方面不断进行改进，以为更广泛地推广该技术提供条件。

　　酶标抗体技术的改进，首先反映在酶一抗酶(PAP)法技术的出现。以酶一抗酶抗体结合成一个抗原一抗体复合物替代原来酶标抗体技术，解决了酶标记率不高，且易脱落的问题，使EIA的灵敏度进一步提高。

　　嵌合抗体技术的出现，进一步发展了酶一抗酶技术。将抗病毒单抗和抗酶单抗分别解螺，再重组成一个新的单抗。后者由原先二种单抗相嵌而成，一侧F(ab)段具有抗病毒特性，另一侧F(ab)段具有抗酶的特性。这种同时能特异结合二种抗原的抗体，称为嵌合抗体。嵌合抗体技术的出现，简化了操作，提高了灵敏度。

　　以抗病毒单抗与抗人红细胞单抗合成的嵌合抗体，可以疑成象检验血型一样快速、简便的检验HBsAg的凝集反应。乙滴全血加一滴嵌合抗体，几分钟就产生结果。凝集者为阳姓，不凝集的为阴性。很适合儿童检验HBsAg时使用，灵敏度达5—10ng／ml，较RPHA法高。

　　酶免法由于载体的改革带来一系列进展。以硝酸纤维素膜替代微孔板(或珠子)作为一种新的载体，使吸附过程从37℃、2小时简化到常温下几秒种就可完成。这主要是因为硝酸纤维素膜象一层“海绵”，当一滴液体通过它时，液体很快渗透下去，这层“海绵”的每个微孔结构的“壁”又具有极强的吸附性，使液体中的抗原或抗体，在常温下几秒钟即完成吸附过程，较之原来依靠抗原或抗体分子的布朗运动来扩散到微孔板的壁(或珠子表面)迅速得多。同时，硝酸纤维素膜替代微孔板(或珠子)简化了洗涤的方式，使原来洗涤需300txl洗涤液冲入微孔中、停放1分钟的盆浴式洗涤，变成一滴洗涤液加入，疵完成一次简便、快速、高效率的淋浴式洗涤。三滴洗涤液渗过薄膜，全部洗涤过程即告完成。这种点酶标技术使经典的酶免技术的操作大为简化，全部反应半小时即可完成。如果用金属或非金属标记物替代酶标记物，使标记抗体可以直接显轧色，肉眼判断，全部反应过程又可缩短到3—5分钟。这些新的技术的出现，必然会深受临床检验人员的欢迎而迅速得到推广。