瞬时转染真核基因表达调控技术
调节瞬时转染基因的表达
*四环素作为哺乳动物细胞中可诱导基因表达的调控物
阶段一：pTet-tTAk稳定转染成纤维细胞
培养和转染细胞
1. 在DMEM完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有0.5μg/ml四环素-HCl（四环素）的DMEM完全培养液中。每个10 cm培养皿中加入足量细胞，使转染那天，细胞可以有33%的汇合度。
2. 在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每秒质粒的浓度调整为≥0.5 mg/ml。10～20μg质粒pTet-tTAk和1～2μg
pSV2-His（Tet质粒与带选择标记的质粒的摩尔比大约为10：1）与500μl HEPES缓冲液在一个干净的4 ml聚丙乙烯管中混合。
3. DNA混合物中加入32.5μl 2 mol/L CaCl2。立即轻轻振荡使溶液混匀。溶液在室温保存，不时地混匀。15～30 min后会形成絮状沉淀。
4. 吸掉步骤1准备的细胞培养皿中的所有培养液。
5. 用巴斯德吸管混合CaCl2-DNA若干次。滴加混合物，使它均匀地盖在单层细胞上。
6. 细胞在37℃，5% CO2条件下培养30 min，15 min后摇动培养皿，保证DNA沉淀物的均匀覆盖。
7. 每个细胞培养皿中加入10 ml含有四环素的DMEM完全培养液。细胞在37℃，5% CO2条件下培养4～5 h。
8. 轻轻吸掉培养液。避免破坏细胞上的沉淀物。
9. 加2.5 ml含15% 甘油而且预热到37℃的HEPSE缓冲液进行甘油休克。细胞在室温放置2.5 min。甘油是滴加到培养液中。
10. 恰好在2.5 min的时候吸掉甘油溶液。操作得快一点，因为甘油对细胞毒性很大。
11. 立即又轻又快地加入10 ml含有四环素地DMEM完全培养液洗细胞。立即吸掉培养液，再重复洗涤。
12. 细胞中加入10 ml含有四环素地DMEM完全培养液，37℃培养过夜。
13. 转染后大约16～24 h，吸掉培养液，换上10 ml含有四环素的DMEM完全培养液。转染后一共在37℃培养48 h（即步骤12和13的总培养时间）。
转染细胞的筛选和克隆
14. 转染后48 h，细胞用几种稀释度分到含有125μmol/L L-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的培养液中。细胞密度为每个10 cm培养皿大约1×106到3×104。含有大约1×105细胞的培养皿需要培养若干个。
15. 细胞在选择培养液中培养4天后，接着用3～4 ml含有125μmol/L L-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的选择培养液培养。
16. 集落形成后（通常经过大约10～12天选择培养），换成含有250μmol/L L-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的选择培养液。
17. 集落长好以后（选择培养12～15天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。
18. 用大约100μl磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加2滴1×胰酶-EDTA（100μl）并放置30～60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到24孔组织培养液板的一个孔中，每个孔中有1
ml含250μmol/L L-组氨醇和四环素的选择培养液。
19. 当孔中的细胞长到80%汇合度，把它们转移到6 cm组织培养皿中，用含有500μmol/L L-组氨醇和四环素的选择培养液。
20. 细胞在含有500μmol/L L-组氨醇和四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行1：5到1：10稀释）。
细胞进行蛋白诱导表达测试
21. 当单层细胞再次生长到大约80%汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试蛋白的诱导表达。
22. 如果细胞用tTA和靶质粒共转染，可以如阶段3所述直接分析靶基因的产物。如果细胞只用pTet-tTAk质粒转染，如下进行细胞的诱导表达测试：
a. 诱导前一天，细胞以适当的密度在含有500μmol/L L-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的DMEM培养液培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。
b. 第二天，用PBS细胞洗细胞3次，每次都要轻轻旋转培养板。
c. 第三次洗涤后，立即加入含有500μmol/L L-组氨醇但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养6～48 h。
23. 通过Northern分析或免疫印迹法测试细胞中tTA的诱导表达。然后如阶段2所述，用靶质粒转表达tTA的细胞系。
阶段2：四环素调控的靶基因稳定转染可诱导表达tTA的NIH-3T3细胞
培养和转染细胞
1. 在含有500μmol/L
L-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl完全选择培养液中培养可以诱导表达自身调控的tTA的稳定细胞系（阶段1中的分离得到）。转染前一天，把细胞传代到含有完全选择培养液的10
cm组织培养皿中。每个培养皿转入足量细胞，使转染那天单层细胞可以有33%的汇合度。
2. 在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每种质粒的浓度调整为≥0.5mg/ml。每种靶基因质粒10～20μg和1～2μg
pPGKPuro（每种四环素质粒与带选择标记的质粒摩尔比位10：1）与500μl HEPES缓冲液在一个干净的4 ml聚丙乙烯管中混合。
3. 进行阶段1中步骤3-13。
选择和克隆转染细胞
4. 转染后48 h，细胞用几种稀释度分到含有500μmol/L L-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液中。细胞密度为每个10 cm培养皿大约1×106到3×104。含有大约1×105细胞的培养皿需要培养若干个。
5. 细胞在选择培养液中培养4天后，接着用3~4 ml含有500μmol/L L-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液培养。
6. 集落长好以后（选择培养12～14天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿中挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。
7. 用大约100μl磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加2滴1×胰酶-EDTA（~100μl）并放置30～60
s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到24孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有1 ml含有500μmol/L
L-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液。
8. 当孔中的细胞长到80%汇合度，把它们转移到6 cm组织培养皿中，用含有500μmol/L L-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液培养。
9. 细胞在含有500μmol/L L-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行1：5到1：10稀释）。
10.当单层细胞再次生长到大约80%汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试靶基因蛋白的诱导表达。测试方法在阶段3介绍。
阶段3：分析转染细胞中的蛋白质表达
细胞的生长和诱导
1. 诱导前一天晚上，细胞以适当的密度在含有500μmol/L L-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素-HCl的DMEM培养液中培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。
2. 第二天，用PBS洗细胞3次，每次都要轻轻旋转培养液。
3. 第三天洗涤后，立即加入含有500μmol/L L-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养6～48 h。
收获细胞
4. 细胞生长适当的时间后，快速收获并放到冰浴的管中。
5. 每个克隆和对照都转移0.5×106细胞到离心管中，然后所有管子在4℃以3000 r/min（低或中速）离心5 min。
6. 加1 ml冰冷的磷酸盐缓冲液洗细胞。如步骤5洗细胞，轻轻吸掉上清，不要扰动细胞沉淀。
7. 细胞沉淀放在冰浴上，在离心管架上放的孔中轻快地旋动管子使沉淀变松，然后把它冻存在-70℃。
准备裂解物
8. 细胞沉淀用30μl蛋白样品缓冲液重悬，轻轻地吹打细胞，然后振荡管子。
9. 细胞在蛋白样品缓冲液中煮10 min。
10. 以最大速度离心2 min收集细胞碎片。
11. 在Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶的每个冰道加10μl细胞裂解物。
12. 用合适的时间跑胶。
13. 蛋白从SDS-聚丙烯酰胺凝胶电转移到PVDF膜上，用合适的抗体检测。
