聚合酶链反应（PCR） 技术--引物设计的注意事项

扩增已知基因时经过初次筛选和二次筛选后得到的引物基本上能够满足要求,但是当运用比较基因组学分离新基因时,设计引物还应注意以下两点:

① 模板的选择。如果以DNA为模板设计引物, 首先在Genebank中找到与待分离新基因同源的其它物种的该基因。

利用工具把已检索到的基因进行同源性比较,根据比较基因组定位的原理,选择研究深入、标记稠密的人和哺乳动物(如小鼠)保守功能基因DNA序列设计引物,该引物区段要求在各物种间绝对保守,差异不要大于2 bp,特别是3’端必须完全同源。如果以电脑克隆策 略获得的待分离物种新基因的EST一重叠群为模板设计引物,要求ESTs与信息探针之间同源性大于80%,长度大于100 bp,并且避免在EST的并接部位和可能的外显子与内含子剪接位点处设计引物。

②引物序列最好位于相临的外显子区且至少距离外显子与内含子剪接处25 bD以上,这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。