分析测试百科网 > 行业资讯 > 焦点事件

焦磷酸测序在甲基化分析中的应用

2010.12.03

　　DNA甲基化是近年来研究的热点，因为越来越多的证据表明，它参与了胚胎发育、基因印迹等过程。同时，它在疾病发展中也起着举足轻重的作用。甲基化状态的改变被认为是引起癌症的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。

　　DNA的甲基化分析，有很多条路可以选择，从亚硫酸氢盐转化这条主干道出发，之后可以选择限制性酶切分析、实时定量PCR、测序和焦磷酸测序等。然而，并非所有方法都能提供单个CpG位点的定量数据。亚硫酸氢盐处理+测序一度被认为是甲基化分析中的金标准，但如果对5-10个克隆测序，这种方法充其量只是半定量。

　　焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。

　　通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。

　　同时，新一代测序(NGS)在甲基化研究中也开始崭露头角。454(后被罗氏收购)以焦磷酸技术为基础，开发出了新一代测序平台。之后，Illumina的Solexa测序仪和ABI的SOLiD测序仪陆续推出。这些大规模并行测序平台带来了不断提高的通量，同时使测序成本不断下降，目前正广泛应用于基因组测序和重测序、转录组分析和表观基因组研究。对于甲基化研究，这些平台带来了非常灵敏的DNA甲基化图谱，以单分子分辨率覆盖整个CpG岛。

　　新技术不断涌现，我们在实际应用中应如何选择，才能发挥出它们本身的优势。科学家们也在不断探索。德国汉诺威医学院Anna Potapova领导的研究小组对454测序和QIAGEN的焦磷酸测序进行了系统的交叉验证。在今年1月的《BMC Biotechnology》上，他们发表了他们的研究成果1。

　　研究人员分析了10个原发性肝癌标本中12个位点的甲基化模式。他们先对基因组DNA开展亚硫酸氢盐修饰，再利用120对引物对选定的位点进行扩增，之后开展454测序和焦磷酸测序。他们将454测序所获得的单个CpG位点的甲基化水平与传统焦磷酸测序的相应值进行了比较。统计分析表明，所有单个CpG位点的甲基化水平都有着极佳的一致性。

　　作者认为，高通量的454技术实现了整个CpG岛的更全面覆盖，且单分子分辨率为甲基化模式的异质性提供了前所未有的信息。它能够平行研究多个位点。同时，作者也强调，这些优点也伴随着一些劣势，比如相当大的一笔投资、试剂昂贵、周转时间长、数据分析要求高等。这些特点使得454测序更适用于在基因组范围内目标区域的确定，而对不同样品在目标区域的CpG位点的定量分析由于样方数量大，如果每个样品都采用 454技术进行分析，则成本就会过于巨大。

　　相比之下，QIAGEN的焦磷酸测序更快、更简单，且便宜得多。它能够以相同的准确性和分辨率带来同样高分辨率的数据，而费用只有454测序运行的一小部分。如果是针对已确定的目标区域进行甲基化定量分析，那么传统的焦磷酸测序不啻为最佳方法。与之相印证的是，目前QIAGEN的焦磷酸测序技术已逐步应用于临床诊断中，如消化道肿瘤相关的KRAS基因，BRAF基因的突变检测，肺癌相关的EGFR基因突变的检测，以及白血病相关的NRAS基因突变的检测。

　　这篇文章中的数据展示了454测序和QIAGEN焦磷酸测序对大部分CpG位点带来了明显一致的结果，即使是那些表现出不同甲基化模式或甲基化水平极低的位点。作者强调：“在我们看来，传统的焦磷酸测序和454测序并非竞争方法，而是互补方法，它们在DNA甲基化分析领域执行了不同的功能。”

　　美国亚特兰大疾控中心的研究人员也曾利用焦磷酸测序技术，来定量PRFI启动子的甲基化水平2。PRFI基因在免疫监视中发挥重要作用，其启动子区域CpG位点的差异甲基化导致了PRFI的差异表达。研究人员以焦磷酸测序为基础，开发出一种方法，来定量32个 CpG位点的甲基化水平。他们认为，这种位点特异的定量方法非常适合免疫功能紊乱等疾病的大规模分子流行病学研究。

　　QIAGEN 的PyroMark平台用于特定区域CpG位点分析，除了提供每个位点的甲基化程序信息之外，还很好地解决了甲基化检测中很重要的一个环节——亚硫酸氢盐转化完整性质控。由于在人类与动物中，模板序列中后面不是鸟嘌呤G的胞嘧啶C不会被甲基化，因此通过亚硫酸氢盐的处理和PCR 后转化成胸腺嘧啶T。如果所有模板的这些位置都显示出胸腺嘧啶T，而不是胞嘧啶C，即可确认实现了完全的亚硫酸氢盐转化，这些结果均可在测序结果中一一体现(图1)。

　　图1. 多个相邻的CpG 位点的分析。在单次焦磷酸测序运行中定量9个独立的CpG 位点的甲基化(以灰色突出显示)。分析序列背景中位点特异的信息代表了广泛的序列甲基化模式。注意含有胞嘧啶的内置质量控制位点(以暗黄色突出显示)转化成胸腺嘧啶，说明被处理DNA 的亚硫酸氢盐转化充分。

　　除了甲基化分析，QIAGEN焦磷酸测序的优势还让它成为高通量和单个位点分析的理想选择，包括基因分型和等位基因拷贝数定量，微生物鉴定和耐药性分型，以及基因组测序研究的数据验证。

　　QIAGEN目前提供了三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMark Q24可对最多24个样品进行焦磷酸测序。需要大样品量的应用更适合在PyroMark Q96 ID 上进行。考虑到处理成百上千个样品需要大量试剂，而运行通量最大化可能会使实验成本变得很高。故PyroMark Q96 MD 装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行准确测序。

　　除了焦磷酸测序仪，QIAGEN还提供了多种产品，覆盖甲基化研究的每个流程，包括样本的采集和稳定，基因组DNA 纯化，亚硫酸氢盐转化及CpG位点的甲基化检测，针对人类基因组的所有CpG位，QIAGEN 还提供经生物信息学验证的Assay，用户可直接使用而无需进行实验设计。

甲基化焦磷酸

喜欢作者我要约稿