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结缔组织类细胞培养实验——巨噬细胞培养实验

2019.4.04

实验方法原理	巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2~3 周，因之多用作初代培养。巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A.1、RAW309、Cr.1 等，均已获恶性。培养中的巨噬细胞仍保留着原有形态特点和吞噬异物功能，并易于传代和从培养瓶壁分离，但却难以建立成为传代细胞系。
试剂、试剂盒	Eagle 肝素血清
仪器、耗材	解剖台蜡板镊子解剖剪注射器针头离心管吸管培养瓶细胞计数器
实验步骤	培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外，培养方法大同小异。 1. 实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1 ml（勿注入肠内）； 2. 引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70 %酒精中3~5 秒； 3. 置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁； 4. 再用70 %酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10 ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动； 5. 用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内； 6. 小心拔出针头，把液体注入离心管中，250 g（4 ℃）离心10 分钟后，去上清，加10 ml Eagle培养基； 7. 计数细胞，每只小鼠可产生20~30×10⁶ 细胞，其中90 %为巨噬细胞； 8. 为获取3×10⁵ 个贴附细胞/平方厘米，需接种2.5×10⁶ /ml； 9. 为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1~2 次后，再加新Eagle培养液置37 ℃CO₂温箱中培养。展开
其他	一、培养技术要点 1. 来源和取材巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。在不加任何刺激物自然情况下，一个小鼠腹腔中，就含有2~3×10⁶ 个细胞，而且大多无炎症反应，冲先出来即可用于培养。如欲获取多量巨噬细胞，可于取材3~5 天前，向动物腹腔中注射刺激物，便能获得大量细胞。刺激物种类很多，如牛血清、矿物油、硫羟乙酸盐肉汤等，均能刺激产生大量巨噬细胞；缺点是很多刺激物能激活吞唾细胞并被其吞噬，进行培养以后，刺激物常不能很快被消化掉，残留在细胞内，能干扰细胞代谢。用40 μg的PHA注入腹腔中，能产生6~8×10⁶ 个细胞，而且无刺激性，效果较好。从500 ml血中能获取10⁸个单核细胞，但易杂以血小板及其它白细胞，尚需做进一步的分离和纯化。 2. 纯化和分离从各种来源和用各种方法所获的巨噬细胞群中，多混有其它细胞成分，如淋巴细胞、中性细胞、血小板和成纤维细胞等，应把它们分离出去。附着分离法比较实用，原理是借用大多数单核巨噬细胞有极易附着于玻璃表面的特性，在先把细胞群置于玻璃培养容器中数小时后，巨噬细胞能最先附着于玻璃表面，此时再用培养液或PBS 冲洗掉尚未附着的中性粒细胞和激活的T 淋巴细胞等，剩余巨噬细胞纯度可达95 %。如中性粒细胞也附着，可继续延长时间至24 小时，此时大多数巨噬细胞都已附着于瓶壁，而中性粒细胞可变性死亡。继之再从瓶壁上把巨噬细胞分离下来进行培养，便获得纯净巨噬细胞。巨噬细胞对胰蛋白酶和EDTA均不敏感，不易使之离壁，必要时可用胶刮刮除，但可能损伤细胞。用不加防腐剂的纯利多卡因处理（干液为PBS配的360 mM液，用1 N NaOH调节pH值到6.6，同时稀释成12 mM浓度），加入培养基中，37 ℃作用5 分钟，可使巨噬细胞变圆，此时稍加吹打，即可使细胞分离。注意要控制好作用的时间，以免细胞丢失。 3. 培养条件据实验目的不同，可选用各种培养基：如199（加新鲜谷氨酰胺加青链霉素）；NCTC-135；RPMI 1640；Ham12等均适于巨噬细胞培养。大多数巨噬细胞培养可加10 %~40 %的血清，小鼠巨噬细胞加10 %小牛血清，用无血清培养基亦可。新生小牛血清中含有抗体，能刺激巨噬细胞成熟。也可用乳清蛋白培养。巨噬细胞适于CO₂温箱培养，pH7.2，细胞接种密度以2~4×10⁵/cm²为宜。 4. 生物性状和鉴别培养中的巨噬细胞在很多方面与淋巴细胞或其它白细胞相似，应严加区别。正常巨噬细胞能附着瓶壁，胞质延展，细胞大小介于10~50 微米之间，胞核呈特有的肾形，胞质有皱褶，细胞群多时能连接成单层；有时细胞呈多角形并连接成网状。巨噬细胞对胰蛋白酶有抵抗性，借此可下其它细胞相区别，也是淘汰其它细胞的方法。单核巨噬细胞胞质中含有丰富的非特异性脂酶，并具有C3b和FC表面受体。巨噬细胞对培养环境敏感，很易发生与在体内时很大不同的改变；有强烈的吞噬活动。如向培养环境中加入淀粉粒、乳胶粒、红细胞及调理素（或新鲜血清、特异抗体）等，可见巨噬细胞能吞噬五个以上的颗粒。细胞状态不良时，胞质常不延展，胞体变圆，不透明，或脱离瓶壁飘浮在培养液中和失去吞噬能力。展开