实用哺乳动物细胞培养手册（中）
细胞培养环境
1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受 其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响， 要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌 操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一 室。
2、常用设施及设备
（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作 台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及 消毒好的无菌物品等。
（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物
（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。
3、培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品 或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。
（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有 500 ml、250 ml、100 ml 等几种。
（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细 胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于
1 cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有 200 ml、100 ml、50 ml、25 ml、10 ml 等几种。
（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径 30 mm、60 mm、120 mm 等几种。
（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有 球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用 1 ml 和 10 ml 两种。短吸管也叫滴 管，分弯头和直头两种。
（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用 于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为 50 ml、
30 ml、15 ml；后者则多为 10 ml 和 5 ml。
（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。
4、细胞培养温度
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为 36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过 39℃ 时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在 39-40℃1 小时，即能受到一定损伤但仍有 可能恢复；在 40-41℃1 小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1 小 时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；
当温度在 43℃ 以上 1 小时，细胞全部死亡。相反，温度不低于 0℃ 时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作 用；把细胞放入 25－35℃ 时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在 4℃ 数小时后，再回到 37℃ 培养，细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。
当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如－80℃ 或－196℃（液氮）长期保存。
5、合适的气体环境
气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧
气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。 开放培养时一般把细胞置于 95% 空气加 5% 二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基
的 pH 值。大多数细胞的适宜 pH 为 7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。 但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏 碱环境中生长，如成纤维细胞最适合 pH 是 7.4-7.6。每种细胞都有其最适 pH 值。
细胞培养无菌操作基本技术
无菌操作技术分为三个部分：工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。
工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段。超净工作台正常工作时，向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。
（1）实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射 30-60 分钟灭菌，用 70% 酒精擦拭无菌 操作台面，并开启无菌操作台风机运转 10 分钟后，才可开始实验操作。每次操作只 处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。如需 要继续进行下一个实验，则用 70% 酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运 转 10 分钟后，才可进行下一个实验操作。
（2）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以 暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用 70% 酒精 擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘 非无菌区域操作。
（3）小心取出无菌实验用品，避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要 在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。
（4）工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性 或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过 程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖 锐物品伤人等。
（5）定期检查下列项目：CO2 钢瓶内的 CO2 压力；CO2 培养箱内的 CO2 浓度、温度、及水盘 是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及 HEPA 过滤器滤膜， 预滤网 ﹙300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA）。
培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期
潜伏期 (latent phase)
细胞接种后, 先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期. 此时, 细胞质回缩, 胞体呈圆球形. 然后细胞贴附于载体表面, 称贴壁, 悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基 成分, 载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢, 可达 10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常 10-30 分钟即可贴壁。
细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期. 原代培养细胞潜伏期长，约 24-96 小时或更长, 连续 细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需 6-24 小时。
(2) 指数增生期 (logarithmic growth phase)
这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为 判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表 示，即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于 0.1%-0.5%，原 代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达 3％－5％。
指数增生期 的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细 胞数量适宜情况下，指数增生期持续 3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少， 最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑 制现象 (contact inhibition)。
而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致 细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接 触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。
但是，当 细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代 谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。
（3）停滞期 (Stagnate phase)
细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时 细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如 不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出 现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。
培养细胞基本形态
培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有 1-2 个核仁。在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔 泡等，表明细胞代谢不良。
体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生 长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。如羊水细胞为贴 附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
（1）成纤维型细胞 在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出 2-3 厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外， 凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
（2）上皮型细胞 此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。
（3）游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常 见于羊水细胞培养的早期。
