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植物原生质体融合的原理及进展

2020.3.04

  摘要

  本文对植物的原生质体融合技术得研究进展进行了综述。阐述原生质体制备、培养方面的研究进展,随后介绍了原生质体融合方法、融合机理和融合方式等的研究进展,最后对其今后的应用前景进行了展望,为原生质体融合技术的发展提供了参考。

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  关键词

  原生质体 融合技术 研究进展

  01

  —

  原生质体制备

  1.材料的选择及预处理

  许多研究表明,在原生质体分离之前,先对植物材料进行预处理能够有效提高原生质体的游离效率,在同等材料用量下可以分离出较多的原生质体。柳玉晶等[1]的研究表明,在分离百合叶片原生质体前对其进行13%甘露醇预处理和黑暗处理能显著提高原生质体产量。而在草莓试管苗原生质体分离前,材料预先进行低蔗糖或暗处理均能显著提高原生质体产量[2]。

  2.原生质体分离

  机械分离法是较早采用的一种原生质体分离方法,其操作步骤繁琐且原生质体产量低,该方法已逐渐被酶解分离法取代。酶解分离法,是目前普遍采用的原生质体分离方法。酶解分离法常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶等,前3种酶主要是使细胞壁分解释放原生质体,后一种酶主要作用于细胞间的果胶质,使细胞分离[3]。不同植物原生质体分离所需酶种类、浓度及处理时间均存在差异。张小红等[4]发现小麦愈伤组织在 2.0%纤维素酶、0.5%果胶酶和0.6 mol/L甘露醇溶液中酶解4~6 h获得原生质体产量和活力较高。而葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6 mol/L甘露醇溶液中,酶解14 h为宜。

  02

  —

  原生质体培养

  1.培养方法

  液体浅层培养、固定培养(包括低熔点琼脂糖包埋和海藻酸钠包埋)、固液双层培养、琼脂糖念珠培养和看护培养是原生质体培养常用的几种方法[5]。不同植物原生质体培养最适的培养方法不尽相同。李玉珠等[6]研究发现,固液双层培养较液体浅层培养法更有利于苜蓿原生质体的早期培养和再生。而月季[7]、天竺葵[8]、六出花[9]等原生质体液体培养效果优于固体培养。相关研究发现,与液体培养、固体培养和固液培养相比,看护培养是百合原生质体培养的最佳培养方法[10-11]。

  2.培养密度

  原生质体密度是影响生长的一个很重要的因素。密度过低,单位面积上细胞数目少,原生质体间空隙大,原生质体内含物外渗,完整性受破坏,引发褐变,不能继续分裂或短暂分裂后便衰亡;密度过高,培养空间狭隘,因营养竞争使得再生细胞团较小,正常生长受阻。不同植物原生质体其培养密度不同,一般培养密度为5×102~1.0×106mL-1[12]。芸薹属原生质体培养密度一般为0.5×105~1×105mL-1,拟南芥在5×103~1×104 mL-1的低密度下仍可进行持续分裂并能发育成细胞团[13]。

  03

  —

  原生质体融合方法及其机理

  原生质体融合分为自发融合和诱导融合两种。自发融合是指在分离原生质体期间原生质体经常自发地 合并的现象[14]。在融合诱导化学试剂的作用下不同来源的原生质体融合称为诱导融合。正常情况下,分离的原生质体彼此并不融合,因为分离的原生质体表面携带负电荷(10mV -30mV)围绕原生质膜的外部。因此,这种类型的融合需要一种融合诱导化学物质或者外力来减少原生质体的负电性,允许原生质体融合[15]。

  诱导分离的原生质体融合主要有机械融合法、化学融合法和电融合法三种方法。

  1.机械融合法

  分离的原生质体在显微操作仪下产生紧密的物理接触而融合。

  2.化学融合法

  化学融合剂引起分离的原生质体彼此粘附,导致紧密粘着产生融合[16]。化学融合是一种非特异性、费用低的、能够产生大量融合产物的融合方法,但是这种方法缺点是可能对细胞有毒、非选择性和融合效率低。

  2.1 高pH-高浓度钙离子融合法

  一般情况下,与钠离子和钾离子比较,钙离子影响细胞融合的效率是很低的[17],但是在高 pH 环境中高浓度钙离子会诱发融合效应。

  2.2 PEG 融合法

  PEG 是一种大分子(分子量 1000-6000)的水溶性的多聚化合物。一般地使用28-50%PEG 溶液用于细胞融合。因为 PEG 液比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强,一般使用两种实验方法完成原生质体融合。

  方法一,取大约 0.6ml 的 PEG 融合液(20~45%PEG,moL.wt.1500, 0.1M甘露醇、山梨醇或 蔗 糖 , 8-10 mmol CaCl2, 和0.7mMKH2PO4,pH 5.6)以滴的形式添加到试管中的原生质体中。在盖好试管后,PEG 中的原生质体在室温温育 40min。偶尔旋转试管使原生质体接触。在每间隔 10 min 后向试管中添加 0.5-1ml 的原生质体培养基来稀释 PEG。离心除去融合液,将原生质体沉淀悬浮在培养液中。方法二,取两种原生质体(密度为 1×105 个/毫升)混合液(比例为 1:1)0.1-0.5ml,静置 3~5min。首先加入融合液 A (2-8mM CaCl2,0.5-0.7mM KH2PO4 , 0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇,25%-30%PEG(wt.6000),pH 5.8)0.1-0.5ml,25℃保持15-20min;然后加入融合液 B(2-8mM CaCl2,0.5-0.7mM KH2PO4 , 0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇,pH 7.0-10.0 )0.1-0.5ml,25℃保持 10-20min,完成原生质体的融合;再用培养液洗涤(3~4 次),离心(100×g)5min,可以用来观察和培养,这种 2 步融合法在实验室中广泛应用。有学者对 PEG 介导的原生质体融合方法进行了改进,由原来的 2 步融合分为 3 步,逐渐降低 PEG 的浓度,逐步提高溶液中Ca2+的浓度和 pH 值,微量化且省略了离心步骤,操作更简单[18]。

  PEG 诱导原生质体融合的机理是,带有大量负电荷的PEG 与水之间的氢键结合,使溶液中自由水消失,由于高度脱水引起原生质体凝集,形成大小程度不同的凝集物,邻近的原生质体之间紧密接触;PEG 带有大量的负电荷,能够结合 Ca2+,与原生质体表面的负电荷连接,形成静电键,促使异源的原生质体间的粘着和结合;此外,PEG 分子具有轻微的负极性,可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键,在相邻的原生质体间起到分子桥的作用,使原生质体接触。在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位,膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。

  04

  —

  展望

  目前,通过体细胞杂交技术研究,不仅创造了许多融合方法和融合方式,而且对杂种细胞的筛选以及杂种植株的鉴定和培养进行了大量的工作,取得了很大进展,但是也存在一定的不足。原生质体杂交需要筛选杂种细胞,杂种细胞再生能力差,杂种植株性状较差(不育、生根能力差、生长势较弱等)是原生质体融合技术中的主要问题。因此,需要研究诱导融合及杂种细胞的各种生理生化和遗传机理。开展各种植物的原生质体再生技术研究。探索外源遗传物质导入原生质体的条件及研究其在原生质体中的表达机制。研究杂种细胞培养和杂种植株的鉴定。将原生质体融合与遗传转化、常规杂交等育种方法结合起来, 更有效地转移优良性状, 创造优异种质,使这一技术成为研究植物改良和基因相互作用的一种有效的手段。

  参考文献

  [1] 柳玉晶.百合原生质体分离及培养的研究[D].哈尔滨:东北农业大 学,2006.

  [2] 金晓玲,何平.木本植物原生质体培养与融合研究进展[J].浙江师 范大学学报:自然科学版,2003,26(1):54-59.

  [3] 王国平.原生质体融合技术在枣育种中的应用展望[J].分子植物育 种,2008,6(3):555-560.

  [4] 张小红,闵东红,邵景侠.小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与 纯化[J].中国农学通报,2010,26(21):49-53.

  [5] 彭邵锋,陆佳,陈永忠,等.木本植物原生质体培养体系研究进展[J]. 中国农学通报,2013,29(1):1-6.

  [6] 李玉珠,师尚礼.杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选 [J].西北植物学报,2014,34(1):184-192.

  [7] Kim S W, Oh S C, In D S, et al. Plant regeneration of rose (Rosa hybridia) from embryogenic cell -derived protoplasts[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture(PCTOC),2003,73(1):15-19.

  [8] Nassour M, Chasseriaux, G, Dorion N. Optimization of protoplastto -plant system for Pelargonium × hortorum‘Alain’and genetic stability of the regenerated plants[J]. Plant Science,2003,165(1): 121-128.

  [9] Endo M, Fujii N, Fujita S, et al. Improvement of plating efficiency on the mesophyll protoplast culture of chrysanthemum, Dendranthema × Grandiflorum (Ram.) Kitam[J]. Plant Biotechnology,1997,14(1):81-83.

  [10] Komai F, Morohashi H, Horita M. Application of nurse culture for plant regeneration from protoplasts Lilium japonicum thumb[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology -Plant,2006,42(3):252 -255.

  [11] 秦晓杰,段华金,朱永平,等.东方百合‘Sorbonne’原生质体培养初步研究[J].分子植种,2013,11(5):600-604.

  [12] Davey M R, Anthony P, Power J B, et al. Plant protoplast technology: Current status[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2005,27 (1):117-130.

  [13] Dovzhenko A, Dal Bosco C, Meurer J, et al. Efficient regeneration from cotyledon protoplasts in Arabidopsis thaliana[J]. Protoplasma, 2003,222:107-111.

  [14]李良材,陈一明,陈英.水稻原生质体培养及植株再生的研 究[J].遗传学报,1988,15(5):321-328.

  [15]Narayanswamy S.. lant cells and tissue cultures. Plant Protoplast: Isolation, Culture and Fusion [M],1994, 391-469. TATA MCGraw Hill Publishing Company,New Delhi, India.

  [16] Pasha C,R.C.Kuhad and C.V Rao. Strain improvement of thermotolerant Saccharomyces cerevessie VS3 strain for better utilization of lignocellulosic substrates[J].J Appl. Microbiol,2007,103:1480-1489.

  [17]KAMEYA T.AND TAKAHASHI X..the effects of inorganic salts on fusion of protoplasts and leaves of BRASSICA species[J].JAPAN. J.GENETICS,1972,47(3): 215-217.

  [18]王幼平,吴晓霞.PEG 介导的原生质体融合方法的改进及注意事项[J].生物学通报,2009,44(1):51.


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