高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法（三）
将纯化定量的水稻品种(93-11)基因组DNA标准样品(0.5~8 ng)与1.0 µL本方法制备的水稻品种(02428)基因组DNA混合作为模板，用InDel 标记引物(表1)进行PCR扩增和PAGE检测。箭头指某反应(或2个反应之间)其02428与93-11条带的信号值大致相等(即DNA等量点)，表明02428基因组DNA量与相应的标准DNA相当。
Different amounts (0.5–8 ng) of standard genomic DNA from a rice variety (93-11) were mixed with 1 µL genomic DNA from another variety (02428), and used as the template for PCR with primers (Table 1) of an InDel marker. Arrows show the band intensities in the reactions (or between two reactions) of 02428 and 93-11 were similar, indicating that the amounts of 02428 gDNA were about the same as those of indicated standards.
表1 本研究所用的PCR引物
Table 1 Primers used in this study
引物编号 Primer No. | 序列 Sequence (5’–3’) | 对应的图 Corresponding Figure |
1 | TGTGTGCTTTCGCTGAAGAGA; TGTGCTCAGCCATAGGGTGTGTT | 图1 Figure 1 |
2 | CGACATGTTGGCTATAAGG; ACCGGCCAATATTCCTTTG | 图2-A~C, E,F Figure 2 A–C, E,F |
3 | ATGGTACTACACACGTTTGT; GAAACTCATACCTTACTTCA | 图2-D (左) Figure 2 D (left) |
4 | TGCTCATCCTGCAGCTTCTTC; CGATCGGTTATTAACTCTTCCAT | 图2-D (右) Figure 2 D (right) |
5 | GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC; CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG | 图2-G (上) Figure 2 G (up) |
6 | GAGGTAGAAACCCACCCTAAA; CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG | 图2-G (下) Figure 2 G (down) |
7 | CCCTTACGTGCAGTACATTG; ATGCAGGCTACTTACTAGCG | 图3-A Figure 3 A |
8 | TCCTCCCTCTGTACCATTTG; ACGCCAAGAAAGTCATATGG | 图3-B Figure 3 B |
9 | TCAACCAGTGAAGGGTCGACG; CTCAGTTGTCACGATGTGAACG | 图3-C (M1) Figure 3 C (M1) |
10 | GCGGTTGTGAAAGGCTAATCC; AAGCAGCAGGAAATGGGAGTG | 图3-C (M2) Figure 3 C (M2) |
2.2 加入不同量模板DNA的PCR效果
在一定量溶液中放入过多此方法制备的gDNA会带入过量的杂质，因而会抑制PCR反应。我们的结果显示，用2~3 mg叶片(150 µL)制备的模板(加入1 µL)的PCR效果(扩增830 bp)比用10~12 mg(150 µL)制备的模板的扩增效果要好(图2-A, B)。进一步检测加入不同容量gDNA(用3 mg叶片150 µL-1溶液制备)的PCR效果表明，20 µL PCR反应中加入上述方法制备的DNA 0.5~1.0 µL的扩增效果比加入2 µL的效果好；加入1 µL DNA和1 µL TE(含有1 mmol L-1 EDTA)的扩增效果更差。说明即使控制好合适的叶片量和溶液的比例，加入过量DNA溶液也因带入过多的杂质和EDTA(制备液含有EDTA)而抑制PCR反应。因此，本方法的关键是要控制适合的叶片量和溶液的比例，同时加入的DNA溶液量不要超过PCR反应液的1/10。事实上，使用少至0.1~0.2 µL的模板DNA(约0.2~0.4 ng)就足以产生良好的PCR扩增效果(图2-D)，说明模板DNA量(指低量)不是一个限制性因素。虽然将较高浓度的DNA(放入较多的叶片量)稀释使用也可避免抑制PCR，但从操作的简单化和效率化考虑，最好直接确定一个合适的叶片量与溶液比例范围，以减少操作步骤。在实际操作中只摘取1段长度与96孔板深度相当的幼叶放入各孔中，由于只有下端约8 mm以下部分才能被合金珠打碎，因此不会产生叶片量与溶液比例过高的问题。用本方法也可从干燥叶片制备模板DNA做PCR(同样要注意控制投入的叶片量不能过多，图3-E, F)，适合于对野外采集和干燥保存的植物样本的检测。用本方法从其他植物制备的基因组DNA(如拟南芥，图2-G)做PCR也产生良好的效果。
图2 用本方法制备的植物gDNA的PCR扩增效果
Fig. 2 PCR effects using the prepared gDNA templates
A, B: 分别从约2~3 mg水稻苗鲜叶片150 µL-1缓冲液和约10 mg水稻苗鲜叶片150 µL-1缓冲液制备的DNA，取1.0 µL gDNA为模板进行PCR扩增。 C: 从3 mg水稻苗叶片 150 µL-1缓冲液制备的gDNA取不同量为模板进行PCR(20 µL反应)。D: 用递减的不同量gDNA (2~3 mg水稻苗鲜叶片150 µL-1缓冲液) 进行PCR标记(InDel)的扩增。E, F: 分别从2~3 mg水稻干燥叶片150 µL-1缓冲液和约10 mg水稻干燥叶片150 µL-1缓冲液制备的DNA，取1.0 µL为模板进行PCR扩增。 G: 从约2~3 mg拟南芥鲜叶片150 µL-1缓冲液制备gDNA，取1.0 µL为模板进行PCR扩增。A~C, E~G反应为20 µL PCR反应，含有0.8 U Taq酶。PCR条件为95℃ 2 min, 33 循环的94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min。D的PCR条件与图3相同。
A, B: PCR using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of seedling leaf tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. C: Using different volumes of rice gDNA prepared from 3 mg seedling leaf tissue in 150 µL preparation buffer as PCR template. D: Use of decreased amounts of gDNA (from 2–3 mg seedling leaf in 150 µL preparation buffer) for performing PCR with InDel markers. E, F: PCR using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of dried leaf tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. G: PCR using 1.0 µL Arabidopsis thaliana gDNA prepared from 2–3 mg fresh leaf tissue in 150 µL preparation buffer. A–C, E–G were conducted in 20 µL PCRs containing 0.8 U Taq, with thermal conditions of 95℃ 2 min, 33 cycles of 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min. PCR setting and thermal conditions in D were the same as those in Fig. 3.
