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邻位连接技术PLA在蛋白-蛋白相互作用,蛋白磷酸化修饰..

2020.7.13

邻位连接技术PLA在蛋白-蛋白相互作用,蛋白磷酸化修饰的应用


摘要 邻位连接技术(proximityligationassay,PLA),是新研发的一项高灵敏度的蛋白质体外分析技术。该方法利用一对邻位探针(proximityprobes)对靶分子进行双识别,通过连接反应产生可扩增的检测信号,以实时PCR进行放大和检测,将对蛋白质的检测转变成为对DNA的检测,实现痕量蛋白的分析,具有极高的检测灵敏度和特异性。综述了邻位连接技术的原理、研究进展以及该技术在蛋白质分析及疾病诊断领域的初步应用。
关键词 邻位连接技术 邻位探针 蛋白质分析 疾病诊断
中图分类号 Q51
收稿日期:20090210  修回日期:20090413
 通讯作者,电子信箱:bzshenzq@sina.com
邻位连接技术是近几年建立的一种可以用于研究蛋白质的定量、定位、相互作用、修饰以及功能的新
DNA连接技术[1~3]。该技术通过一对邻位探针将特异性蛋白质检测转换为DNA序列分析,可以直接分析复杂的生物样品,检测灵敏度和精确度高。本文总结了国外相关报道,对PLA技术原理,PLA技术的种类进行了系统的介绍,并介绍了该方法在生物标记因子检测、蛋白质相互作用、蛋白质?DNA相互作用以及疾病诊断中的初步应用。
1 PLA技术原理
1.1 PLA技术原理
DNA连接技术早在20世纪70年代首次发现连接酶之后便被应用于实验分析中,最早用于研究tRNA的分子作用机制[4]。此后陆续出现了多种新的连接技术,如用于单核苷酸多态性标记(singlenucleotidepolymorphisms, SNPs) 的寡核苷酸连接分析
(oligonucleotideligationassay,OLA)技术,以及用于基因组和蛋白质组分析的Padlock探针技术[5,6],这种寡核苷酸可以和特定的核酸序列反应环化而进行滚环扩
增(rollingcirclereplication,RCA),而PLA便是应用一种类似机制的探针进行蛋白质检测的技术。
PLA技术检测蛋白质的核心是一对邻位探针。该对探针将单链DNA与一对蛋白识别因子相连接,使其
可以通过免疫吸附或其他方法同步结合到一个待测蛋白分子上。PLA反应分为3步[7](图1),图1中:1)样品与带有靶特异性抗体的一对邻位探针共孵育,2条邻位探针双双与靶相应位点结合;2)加入连接试剂和PCR扩增试剂,在连接酶作用下使得同一目的蛋白上的邻位探针对DNA尾部的游离5′端和3′端与互补序列杂交并发生邻位连接反应,形成一个环状的蛋白质?蛋白识别分子?单链DNA复合物。3)采用实时定量荧光PCR扩增复合物中的单链DNA部分。只有在一对探针均与目标蛋白结合,且相互间距离足够贴近时,邻位连接反应才能够发生,因此PLA的非特异性检测极少,这一优点使得PLA与常规PCR或RCA方法相比,具有更高的特异性和检测灵敏度。

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