2．pBlueScriptII的双酶切消化
1．以如下体系进行EcoRI酶切：
pBSK(+) X µl（6µg）
ddH2O 174-X µl
10×Buffer E 20 µl
混匀，加入限制性内切酶：
EcoRI （10U/ µl） 6 µl
总体积为200 µl。
2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。
3．37℃，水浴1hr。
4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。
5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。
6．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。
7. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
8．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。
9．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。
11．加入以下试剂进行XhoI酶切：
ddH2O 74 µl
10×Buffer D 20 µl
混匀，加入限制性内切酶XhoI：
XhoI （10U/ µl） 6 µl
总体积为200 µl。
12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下
13.37℃，水浴1.5hr。
14．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。
15．4℃，13000rpm，离心15min。
16．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。
17．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀 30min。
18. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
19．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。
20．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
21．自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。
3．载体去磷酸化
1．在40ul双酶切载体中加入以下试剂：
6ul 10×buffer
6ul CIAP（0.01U/ul）
8ul ddH2O
总体积60ul。
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。
3.37℃，水浴1hr。
4．70℃，15min，灭活酶。
5．电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。
4．载体效率检测 1．按以下所示作4 个连接反应：

14℃连接过夜。
1.各取1ul连接产物作电转化（具体流程见电转化）
2.计算克隆数，计算载体相对脱磷效率及连接效率。 五.cDNA双链和载体的连接：
1.连接：
根据载体和cDNA的电泳定量结果，每个样品设置3个比例的连接，
即：insert/vector=1/3 incert /vector=1/1 insert/vector=3/1
按以下体系依次加入：

14℃，连接过夜