微流控技术助分子诊断大跨越
基于PCR的分子诊断是通过引物介导特异性扩增目的基因以检测内源性（遗传或变异）或外源性（病原体）目的基因的存在与否，进而对疾病的诊断和治疗提供信息和决策依据。
其主要的应用场景有传染病的诊断，血筛，肿瘤早期辅助诊断，肿瘤的分子分型，遗传病的诊断，产前诊断，组织分型等。
其中在传染病的诊断和血筛方面，基于PCR的分子诊断能缩短诊断的“窗口期”，并且可以定量对病原体进行检测。
相比于传统的免疫诊断方式而言，有不可替代的优势。基于PCR的分子诊断往往是医院对传染病诊断的“金标准”。
在血筛方面，有数据表明，美国90％以上输血传播HIV和HBV以及75％以上输血HCV的危险性均来自“窗口期”感染献血。
在我国，2015 年 2 月，卫计委和财政部联合印发《关于做好血站核酸检测工作的通知》: 全面推进血站核酸检测工作，确保 2015 年血站核酸检测覆盖全国并优先选择国产核酸检测系统及试剂。
图1. HIV早期诊断，检测RNA含量的分子诊断大大缩短了诊断的“窗口期”
基于PCR的分子诊断分为三步：
核酸的提取和纯化；
核酸在引物约束下特异性地PCR扩增；
扩增产物的检测。
在实时荧光定量PCR里，往往PCR扩增和扩增的产物的检测是同时进行的。在医院的临床应用中，往往为了避免交叉污染，往往需要试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。
图2.基于PCR的分子诊断的一般流程
在第一步的核酸提取和纯化工程中，一般采用的是磁珠法或者硅胶膜法。两个方法的实质都是用二氧化硅颗粒来吸附DNA分子，只不过磁珠法是将二氧化硅颗粒预先固定在磁珠表面，而硅胶膜法是将二氧化硅颗粒均匀固定在两层半透膜之间。
图3.实验室基于磁珠的核酸提取方法
在PCR扩增中，核心是温控。主要因为PCR一般需要变性，退火，延伸三个阶段，每个阶段对应需要不同的温度。
在实际应用中，往往可以采取两种方式来实现温度的切换：
直接温控，对反应腔进行加热或者降温；
预先设置三个处在不同位置的温区，让反应腔在三个温区之间进行空间上的切换。
实际产业化中，往往使用的是直接温控法，即直接升温降温。
荧光检测往往是和PCR扩增同时进行的，以实现实时定量的效果。在实际应用中，可以使用不同波段的荧光标记探针来进行荧光定量，从而实现多通道的检测。
图4. PCR流程以及其相应的典型温度
由于基于PCR的分子诊断的人工操作需要三个实验区，过程费时并且需要专业人员进行操作，整个过程由于人的参与带来许多不可控的因素，所以临床对于全自动的需求高涨。
这一块有几个明星产品：
赛沛（Cepheid）的GeneXpert PCR分析仪
(参考《分子诊断精品之一 GeneXpert PCR分析仪》)
BioFire的filmArray
(参考《分子诊断精品之二 FilmArray多重PCR分析仪》)
IQuum的Liat PCR System
(分子诊断精品之三以后会写...)
AtlasGenetics的io
这几个明星产品的孵化公司中，前三家均被巨头收购，第四家也备受投资机构追捧。
2016年9月，赛沛被丹纳赫以40亿美元收购；
2013年9月，BioFire被生物梅里埃以4.5亿美元收购；
2014年4月，IQuum 被罗氏以4.5亿美元收购；
2016年底，万孚生物以约1.25亿人民币投资Atlas Genetics，获得14.95%的股权。
竞争激烈和受欢迎程度由此可见一斑。值得注意的是，这四个产品都是基于微流控的分子诊断产品。
另外，国内的博晖创新也于2017年发布了一款微流控全自动核酸检测系统。
目前来看，在基于PCR分子诊断的全自动化上，微流控技术具有非常大的优势。下面我们来重点从技术角度来解析这几款基于微流控的明星产品。
生物梅里埃FilmArray
这款产品的一大特色是它能实现比较高的并行检测，而且它采用了巢式PCR技术，使用两对引物扩增，第二对引物结合在第一次扩增的产物的内部，这样增强了PCR扩增的特异性，降低了误扩率。
图5. FilmArray的微流控芯片结构
罗氏cobas Liat
这个产品采用非传统的微流控芯片结构。整个芯片类似于试管形状，检测管包含所有检测试剂并已分装入每一个独立区段，将所有核酸检测程序融为一体。其中包含试剂准备、样本富集、抑制物清除、核酸提取及实时荧光定量检测。分析仪通过对检测管压力推动，将样本从不同区段通过，最后通过温控进行PCR扩增。
Atlas Genetics的io system
微流控芯片内部跟传统的一样，采用的在相应腔室施加正压或者负压来操控微流体的流动，以实现整个检测的流程。但是，这个产品在检测方面采用了电化学检测。
其电化学检测的原理大概为：
先不对称PCR，产生大量单链DNA;
然后单链PCR产物与电化学物质的探针结合，生成双链DNA;
双链DNA产物会被核酸外切酶消化，从而释放出被标记的电化学物质;
最终通过电压扫描判读结果。
图6. 博晖创新的微流控全自动核酸检测系统（HPV）
博晖创新的微流控全自动核酸检测系统：这个产品的微流控芯片也是通过在相应的腔室施加正压或者负压来驱动微流体在芯片中的流动。在此基础上，这个产品结合了机械手臂的优势，进一步降低了单次检测的成本。
此外，2016年来自德国弗莱堡大学的研究团队发表了一套基于离心微流控的分子诊断系统。作为系统的核心，其微流控芯片里做到了试剂的预存储，核酸提取纯化，PCR扩增的全部集成。
图7. Stumpf, F, et al. Lab on A Chip. (2016)
试剂预先存储在棒状的铝箔里，通过不同的离心力来实现试剂的顺序加载；
然后，芯片下方的固定的磁铁完成对芯片里的磁珠的吸附；
转动微流控芯片，芯片下方的磁铁会带着磁珠去往相邻的腔室，从而实现了DNA的提取过程；
提取后的DNA将会等体积的分配到八个PCR反应腔室，每个腔室里分别对应四种荧光通道。这样理论上可以实现单样本32指标的检测。
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综述
