特异性检测溶酶体亚硫酸氢盐新武器：新款智能荧光探针
文章提出了一种新的基于逻辑与的荧光探针(NY-Lyso)，它由吗啉基、半花菁苷和1,8-萘二甲酰亚胺显色团组成，用于特异性检测溶酶体中的亚硫酸氢盐。该智能探针由两个功能部件组成：NY-Lyso探针上的吗啉基对细胞内溶酶体(pH 4.5-5.5)和其他细胞器之间的pH差异产生敏感反应，噻吩和花菁之间的碳碳双键通过亲核加成选择性地与HSO3-反应。
吗啉基和半花菁苷均能通过光诱导电子转移(PET)和分子内电荷转移(ICT)机制独立淬灭发射，因此探针无荧光。当同时存在SO2和H+时，探针在524nm处表现出强烈的荧光发射。也就是说，只有当SO2和pH同时被认为是“输入”时，荧光发射才会被“输出”。值得注意的是，基于该方法的探针不仅具有高选择性、快速响应(小于200s)、极低的检测限(LOD = 20.7nM)和优良的溶酶体靶向性的优点，而且克服了在复杂的细胞pH环境中检测HSO3−的局限性。与以前报道的用于SO2衍生物的生物探针相比，基于逻辑与的荧光探针在性能和应用上都有明显的优势。
图一. NY-Lyso的化学结构及其对HSO3-的传感机理(图片来源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946−11951)
探针由两个功能部件组成:溶酶体靶向基团吗啉基和亚硫酸氢盐的特异性结合位点。该设计策略允许探针同时具有两个响应位点，分别通过PET和ICT控制萘酰亚胺荧光团的荧光。在亚硫酸氢盐存在下，半花菁苷的共轭结构被破坏，通过抑制ICT过程导致荧光强度的部分增强。当将SO2探针复合物暴露在酸性环境中，如溶酶体，吗啉基团将被质子化，PET过程也被阻断，然后导致发射强度显著增加。
由于溶酶体pH值在4.5到5.5之间，作者首先研究了在HSO3-存在和不存在的情况下，pH值对探针NY-Lyso光物理性质的影响。如预期的那样，结果表明pH对探针的作用非常重要。pH = 7.0时，在没有HSO3-的情况下，NY-Lyso由于PET和ICT不发出荧光。当加入HSO3-时，发射强度仍然保持在一个较低的值，说明PET过程仍然在起作用。当pH值下降到6.0，对吗啉基团内的N原子的质子化作用阻碍了PET的作用,导致了在524 nm(Φf = 0.49)出现显著的发射增强。随着体系酸度的增加，HSO3-会优先被H+捕获，导致亲核加成过程受阻，ICT过程被重新激活。为了验证这一机理，作者测试了一系列萘酰亚胺模型的光物理性质。这些结果表明，NY-Lyso可作为pH活化荧光探针用于检测HSO3-，在中性和碱性条件下保持沉默，在弱酸性条件下选择性荧光激活。随后，通过测量NY-Lyso在PBS溶液(10mm, 5% DMSO, pH = 5.5)中的吸收和荧光光谱变化，检测其对HSO3-的光学响应。探针NY-Lyso(10μM)显示主要吸收在475nm。加入HSO3-(0−10当量)后，475 nm处的峰值逐渐减小，颜色由淡黄色变为无色。这些变化可能是由于HSO3-阻断了半花菁苷的共轭结构，从而阻断了ICT通路，因此探针的吸收光谱发生了显著的蓝移。且NY-Lyso(10 μM)几乎没有荧光发射。随着HSO3-浓度的增加，在380 nm激发下，524 nm处出现明显的荧光。当十倍当量HSO3-添加时,荧光强度达到最大。此外，通过分析探针在524 nm处的荧光强度，研究了探针的反应动力学。在不同浓度的HSO3-(0 -60 μM)的条件下，随着反应时间逐渐增加，探针的荧光强度也逐渐增加,并在200 s达到平衡,并可以保持超过60分钟的稳定。实验表明，该探头对SO2的响应速度快，可用于SO2的实时成像。
图二. PBS溶液(10mM,5% DMSO, pH = 5.5)中NY-Lyso(10 μM)在不同浓度的HSO3-(0-100μM)下的紫外光谱变化以及荧光光谱变化 (图片来源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946−11951)
根据上述结果，作者通过记录四种可能输入条件下的荧光光谱，确定了探针在PBS缓冲液中的逻辑与特性。其中，H+和HSO3-为输入，系统524 nm处的发射强度为输出。对于输入，存在和不存在H+或HSO3-分别定义为“1”和“0”。输出荧光“ON”和“OFF”分别定义为“1”和“0”。当有两个输入(1/1)时，荧光强度急剧增加，输出信号为“1”。否则，在其他情况下(没有输入或仅输入一个1)，荧光输出为“0”。
图三. 具有两个输入值的逻辑与门的逻辑方案和真值表 (图片来源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946−11951)
在细胞外酸性条件下，NY-Lyso对亚硫酸氢盐具有良好的光物理特性和响应性能，因此作者继续探索NY-Lyso对活细胞溶酶体中亚硫酸氢盐成像的能力。作者首先对探针进行细胞毒性实验，探针对HeLa细胞的细胞毒性较低，说明NY-Lyso适用于活体细胞成像。与其他含有吗啉基团的溶酶体靶向探针相似，引入吗啉基团显著增加了探针在溶酶体富集的可能性。为了研究NY-Lyso的溶酶体靶向性，进行了共定位实验。HeLa细胞与探针NY-Lyso(10 μM), HSO3-(20 μM)和Lyso-Tracker(0.5 μM)在室温下一起孵育30分钟。如图4所示，细胞在显微镜下显示了来自NY-Lyso的绿色荧光通道，以及来自商业Lyso-Tracker的红色荧光通道。合并后的图像显示两个通道重叠良好， Pearson共定位系数为0.85，证实NY-Lyso可以在活细胞溶酶体中特异性定位。随后，研究了探针对细胞内HSO3-的检测和成像能力。为了测试探针在细胞中的逻辑与特性，作者必须首先调节细胞内外的pH值。一种常用的方法是使用高钾离子缓冲液将细胞的外部pH值维持为一个固定值，然后使用一种K+/H+离子载体的尼日利亚菌素将细胞内部的pH值调节到相同的pH值。此外，分别用20 mM柠檬酸和20 mM HEPES制备pH为5.5和7.4的缓冲液。那么对于H+， pH值在5.5和7.4可以分别定义为1和0。HSO3-HSO3的存在和不存在也分别定义为1和0。如图5所示，作者将细胞分为(1,0)、(0,1)、(1,1)三组，但在未处理的细胞和仅与HSO3-孵育的细胞中，细胞上没有荧光。相比之下,用50μM HSO3-孵化后细胞在pH值5.5成功地观察到524 nm的强烈绿色荧光。通过与细胞外实验结果的比较，作者成功地研制了一种基于逻辑与的荧光探针，用于活细胞中HSO3-的选择性检测。
图四. 不同的pH值下NY-Lyso (10 μM)在HeLa细胞中对HSO3-成像的逻辑与行为 (图片来源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946−11951)
总结：综上所述，华东理工大学朱为宏、王成云、郭志前课题组开发了一种基于逻辑与的荧光探针NY-Lyso，通过PET和ICT机制的调控来检测HSO3-。该探针对HSO3-具有较高的选择性和敏感性(LOD = 20.7 nM)。探针的逻辑与行为允许其荧光在中性或碱性条件下保持沉默，但被低pH和HSO3-的共刺激激活。此外，它被证实具有生物相容性，可用于监测活细胞中的溶酶体HSO3-。与传统探针相比，该探针和基于逻辑与的探针避免了细胞环境中复杂的相互作用，具有更好的选择性和更高的灵敏度。该方法具有较强的可实现性和实时性。
备注：逻辑代数有与、或、非三种基本逻辑运算。它是按一定的逻辑关系进行运算的代数，是用来分析和设计数字电路的数学工具。有三种最基本的逻辑运算：
（1）逻辑与：当A，B都为1时，其值为1，否则为零；
（2）逻辑或：当A，B都为0时，其值为0，否则为1；
（3）逻辑非：当A=0时，A的非为1，A=1时，A的非为0。
