一、药物概述及检测原理

　　硝基咪唑类抗菌药，主要用于治疗和预防滴虫、阿米巴原虫及厌氧菌引起的感染。但由于本类药物有致癌作用，很多国家禁止其用于畜、禽、水产等产品的养殖。我国规定禁止本类药物作为动物的促生长剂。

　　本公司的硝基咪唑类酶联免疫试剂盒使用zui新生物技术开发，具有方便、快速、灵敏等特点。

　　本试剂盒利用硝基咪唑类抗体与硝基咪唑类可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被抗原，再加入标准品（样本）和硝基咪唑类抗体，样本或标准品中的硝基咪唑类药物与固定在酶标板上的抗原竞争硝基咪唑类抗体，再加入酶标记二抗反应，最后加入底物催化显色。此时显色深度与标准品（样本）中硝基咪唑类药物的含量成反比。

　　二、试剂盒内包含组分：

　　标准品工作液：0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb，1 mL/瓶。

　　96孔酶标板：1块

　　硝基咪唑类抗体工作液：1瓶（6mL/瓶）

　　酶标Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）

　　20×浓缩洗涤液：1瓶（30 mL/瓶）

　　组织样品处理液Ⅰ：1瓶（干粉，选配，如有需求请向厂家索取)

　　牛奶样本处理液：1瓶（10ml/瓶，选配，如有需求请向厂家索取）

　　复溶工作液：1瓶（50 mL/瓶）

　　底物A液：1瓶（6 mL/瓶）

　　底物B液：1瓶（6 mL/瓶）

　　终止液：1瓶（6mL）

　　说明书

　　盖板膜

　　自封袋

　　三、用户需要自备的设备和试剂

　　仪器：

　　酶标仪（检测波长450 nm、630 nm）

　　电子天平（精度：0.01 g）

　　离心机（3000 g及以上）

　　生化培养箱（可调4℃，25℃）

　　摇床

　　旋涡振荡器

　　氮吹仪

　　微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排枪）

　　计时器

　　试剂：（试剂均为分析纯）

　　乙酸乙酯

　　正己烷

　　氢氧化钠

　　浓盐酸

　　四、试剂盒特异性

　　试剂盒与其他硝基咪唑类药物的交叉反应率：

　　v 甲硝唑…………………………………100%

　　v 羟基甲硝唑……………………………47%

　　v 羟甲基甲硝咪唑………………………53%

　　v 替硝唑…………………………………2%

　　v 地美硝唑………………………………800%

　　v 奥硝唑…………………………………5%

　　五、样本检测步骤

　　1. 1工作液准备

　　v 组织样品处理液Ⅰ：将粉末药品溶于200ml去离子水即得（如有需求请向厂家索取）。

　　v 组织样品处理液Ⅱ：准确量取400 mL乙酸乙酯和100 mL正己烷，充分混匀后待用。

　　v 洗涤工作液：取1份20×浓缩洗涤液加去离子水19份按照1:19的比例稀释即得。

　　v 0.1M NaOH：称取0.8 g NaOH，加入200 mL去离子水溶解。

　　v 1M HCL：量取1ml浓盐酸，加入11mL去离子水溶解混匀。

　　2. 2样品前处理

　　组织（鸡肉、猪肉）（稀释倍数：0.5）

　　Ø 精确称取2 g均质后的组织样品于50 mL塑料离心管中；

　　Ø 加入2 mL组织样品处理液Ⅰ（见5.1），强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）以使处理液Ⅰ与样本充分接触；

　　Ø 加入8 mL组织样品处理液Ⅱ（见5.1），充分震摇（或涡动）3 min（注：若实验室配置有摇床，可充分震摇1min后使用摇床300rpm 25℃震摇10分钟）；

　　Ø 使用离心机室温3000 g以上离心5 min；

　　Ø 取4 mL上清液于洁净的玻璃离心管中；

　　Ø 使用氮吹仪于50-60℃水浴中吹干溶剂；

　　Ø 加入2 mL正己烷，再加入0.5 mL复溶工作液，强烈震摇1min（或涡动30 s）；

　　Ø 使用离心机室温3000 g以上，离心5 min；

　　Ø 弃去上层正己烷及中间杂质层（注：批量检测样本时使用本公司配套的GK-201型有机相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

　　Ø 取50 μL下层液体进行分析。

　　蜂蜜（稀释倍数：0.5）

　　Ø 称取2.0±0.05g蜂蜜样本至50ml塑料离心管中；

　　Ø 加入2ml 0.1M 氢氧化钠溶液（见5.1），强烈震摇使蜂蜜溶解；

　　Ø 加入4ml 乙酸乙酯,强烈震摇5min（或使用涡动仪涡动3min）使样本与有机相充分接触；

　　Ø 使用离心机室温3000 g以上离心5 min；

　　Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃试管中(注意：不要取到下层水相)，使用氮吹仪于50-60℃水浴中吹干溶剂；

　　Ø 加入0.5 mL复溶工作液，强烈震摇2min（或涡动1min）；

　　Ø 取50 μL下层液体进行分析。

　　原奶方法一（稀释倍数：5）

　　Ø 将采样好的原奶样本解冻后于室温静置平衡30min以上；

　　Ø 将枪头伸入原奶样本下层，小心取出1ml样本加入2ml离心管中（注意：尽量不要取到上层的奶油）；

　　Ø 加入50μL 1M盐酸（见5.1），强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；

　　v 使用离心机室温4000 g以上离心10 min；

　　Ø 取上层清亮液体100μL加入另一干净离心管中（注意：尽量不要取到最上层的奶油），再加入400μL复溶工作液，强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；

　　Ø 取50 μL液体进行分析。

　　原奶方法二（稀释倍数：1）

　　Ø 将采样好的原奶样本解冻后于室温静置平衡30min以上；

　　Ø 将枪头伸入原奶样本下层，小心取出2ml样本加入50ml离心管中（注意：尽量不要取到上层的奶油）；

　　Ø 加入100μL 牛奶样本处理液，再加入6ml乙酸乙酯，强烈震摇5min （或使用涡动仪涡动1min）；

　　Ø 使用离心机室温3000 g以上离心5 min；

　　Ø 取1.5 mL上清液于洁净的玻璃离心管中；

　　Ø 使用氮吹仪于50-60℃水浴中吹干溶剂；

　　Ø 加入1 mL正己烷，再加入0.5 mL复溶工作液，强烈震摇1min（或涡动30 s）；

　　Ø 使用离心机室温3000 g以上，离心5 min；

　　Ø 弃去上层正己烷及中间杂质层（注：批量检测样本时使用本公司配套的GK-201型有机相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

　　Ø 取50 μL下层液体进行分析。

　　生蛋方法一（稀释倍数：1）

　　Ø 量取1ml全蛋样本至50ml塑料离心管中；

　　Ø 依次加入1ml 0.1M 氢氧化钠溶液（见5.1），8ml 乙酸乙酯,强烈震摇5min（或使用涡动仪涡动3min）使样本与有机相充分接触；

　　Ø 使用离心机室温3000 g以上离心5 min；

　　Ø 移取4ml 上清液至10ml玻璃试管中(注意：不要取到下层水相)，使用氮吹仪于50-60℃水浴中吹干溶剂；

　　Ø 加入0.5 mL复溶工作液，1ml正己烷，强烈震摇2min（或涡动1min），离心机室温3000 g以上离心5 min；

　　Ø 弃去上层正己烷及中间杂质层（注：批量检测样本时使用本公司配套的GK-201型有机相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

　　Ø 取50 μL下层液体进行分析。

　　生蛋方法二（稀释倍数：5）

　　Ø 取出1ml样本加入2ml离心管中；

　　Ø 加入100μL 1M盐酸（见5.1），强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；

　　Ø 使用离心机室温4000 g以上离心10 min；

　　Ø 取上层清亮液体100μL加入另一干净离心管中，再加入400μL复溶工作液，强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；

　　Ø 取50 μL液体进行分析。

　　熟蛋（稀释倍数：2）

　　Ø 称取1g熟蛋样本至50ml塑料离心管中；

　　Ø 依次加入1ml 0.1M 氢氧化钠溶液（见5.1），8ml 乙酸乙酯,强烈震摇5min（或使用涡动仪涡动3min）使样本与有机相充分接触；

　　Ø 使用离心机室温3000 g以上离心5 min；

　　Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃试管中(注意：不要取到下层水相)，使用氮吹仪于50-60℃水浴中吹干溶剂；

　　Ø 加入0.5 mL复溶工作液，1ml正己烷，强烈震摇2min（或涡动1min），离心机室温3000 g以上离心5 min；

　　Ø 弃去上层正己烷及中间杂质层（注：批量检测样本时使用本公司配套的GK-201型有机相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

　　Ø 取50 μL下层液体进行分析。

　　3. 3检测

　　准备：将要使用的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品的位置，为减小检测值波动建议做双孔平行实验（每个样本/标准品点两孔），未使用的酶标板条用自封袋密封后，保存于2-8℃环境中以防变质；

　　加样：向对应微孔中加入标准品工作液/样品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL抗体工作液；

　　孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于4℃避光反应60 min；

　　洗涤：取出酶标板后小心揭开盖板膜，倒出板孔中液体后，在每孔加 250 μL洗涤工作液，浸泡15-30s后倒掉洗涤工作液，然后再加入洗涤工作液重复洗涤3~4次后，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍干；

　　加酶：在每孔中加入100 μL酶标Ⅱ抗工作液（洗涤后的酶标板在加酶前不宜在室温环境过长时间放置，以防微孔干燥导致实验结果差异）；

　　孵育：轻轻振荡酶标板10 s，盖好盖板膜于25℃避光反应20min；

　　洗涤：按照前面叙述的方法再次洗涤酶标板；

　　显色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必须按体积1:1充分混合，混合液在10 min内使用，切不可使用金属容器盛装、搅拌试剂以免底物变质失效）；

　　孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应15 min；

　　终止：在反应后的微孔中加入终止液50μL/孔，底物液由蓝变黄表明终止成功。

　　读数：终止后的酶标板应在5 min内用酶标仪读数，建议使用450 nm、630 nm双波长读取酶标板吸光度值。

　　4计算结果

　　设各标准品（或样品）的吸光度平均值为B，零标准（浓度为0 ppb的标准品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%为各标准品（或样品）对应的吸光度的百分比：

　　使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线。

　　将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，最后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中检测物含量。

　　六、试剂盒参数

　　Ø 试剂盒灵敏度：0.1 ppb；

　　Ø 标准曲线范围：0.1 ppb-8.1 ppb；

　　Ø 板内变异系数：<5%；

　　Ø 板间变异系数：<15%；

　　Ø B0吸光度ZUI佳值：>0.8；

　　Ø 回收率：90%±30%

　　Ø 样品最低检测限：

　　猪肉、鸡肉…………………………………………约0.5 ppb

　　蜂蜜…………………………………………………约0.1 ppb

　　原奶方法一…………………………………………约1 ppb

　　原奶方法二…………………………………………约0.2ppb

　　生蛋方法一…………………………………………约0.5 ppb

　　生蛋方法二…………………………………………约1.5 ppb

　　熟蛋……………………………………v……………约1 ppb

　　注：ppb=ng/mL或ng/g。

　　七、分析限制

　　本试剂盒为定量或半定量试剂盒，建议用于大量样本筛查分析。若检测结果为阳性，建议使用仪器方法开展确证实验（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

　　八、试剂盒贮存条件及有效期

　　Ø 试剂盒贮存在2-8℃有效期为一年，切勿冻存。

　　Ø 未使用完的酶标板条须密封保存2-8℃的环境中。

　　九、注意事项

　　Ø 使用试剂盒前，请务必仔细阅读说明书。

　　Ø 试剂盒使用前，需将盒内各组份置于实验台上回温至室温（25±2℃）（提示：约1 h）。

　　Ø 试剂在使用前许摇匀，混合时应避免出现气泡。

　　Ø 枪头为一次性用品，为防止试剂交叉污染，检测过程中所用枪头不得重复使用。

　　Ø 请勿使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。

　　Ø 样品处理完毕后请立即分析，否则可能影响检测结果。

　　Ø 底物A液、底物B液均为无色透明液体，若在使用前已变成蓝色，或混合后立即变蓝，说明试剂已污染或变质。

　　Ø 加样过程在保证精度的前提下一定要迅速，以免反应时间差对检测结果产生影响。

　　Ø 终止液中含有硫酸，若不小心溅上皮肤或衣物请立即用大量清水冲洗。若不慎ru眼，请在彻底清洗后去医院检查。

　　炭疽杆菌(BA)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)