试剂、试剂盒 洗涤缓冲液SDSSSCBlocking 溶液经过剪切的鲑鱼精 DNA探针

仪器、耗材 沸水浴杂交炉

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

高严格性洗涤缓冲液（0.2XSSC，5 g/LSDS），预热到 68°C(可选，见第 9 步）

低严格性洗涤缓冲液（2XSSC，5 g/LSDS)，预热到 68°C(可选，见第 9 步）

SDS，5 g/L(可选，见第 9 步）

SSC，20X（1L 配方：175.3 gNaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠,pH7.0)

2. 核酸和寡核苷酸

Blocking 溶液 [含有 2 mg/ml 未纯化的 NP1、NP2R、cDNA 合成引物（使用 cDNA 的情况下），以及它们的互补寡核苷酸]

经过剪切的鲑鱼精 DNA（10 mg/ml)

3. 探针

纯化的检测者和驱动者探针，随机引物法标记（每 100ng 消减 DNA 至少 107cpm)(可选，见第 9 步）

4. 专用设备

沸水浴

杂交炉，预热至 72°C

5. 附加试剂

ExpressHyb Hybridization Kit(Clontech)

放射自显影所需的试剂与设备

二、方法

1. 使用商业试剂盒，用随机引物法标记驱动和检测 DNA 探针。这里所给的杂交条件是根据 Cbntech 的 ExpressHyb 溶液来优化的；对于其他系统，应该根据经验来确定最佳杂交条件。

2. 为每张膜配制足够体积的预杂交溶液。

a. 混合下列溶液：5ul 20XSSC，5ul 经过剪切的鲑鱼精 DNA(10 mg/ml) 和10ul 阻断溶液 [含有 2 mg/ml 未纯化的 NP1、NP2R、cDNA 合成引物（使用 cDNA 的情况下），以及它们的互补寡核苷酸]。

b. 将阻断溶液煮沸 5 min, 然后在冰上冷却。

c. 将阻断溶液与 5 ml ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech) 混合。

3. 将每张旗放到第 2 步配制的预杂交液中，72°C 振荡条件下预杂交 40~60 min。

在预杂交液中加入阻断溶液是很重要的，因为消减探针与所分析的克隆具有相同的接头序列，不管其内部序列如何, 这些探针都能同所有克隆杂交。

4. 制备杂交探针。

a. 混合下列溶液：50ul 20XSSC,50ul 经过剪切的鲑鱼精 DNA(10 mg/ml),10ul 阻断溶液，以及纯化的探针（每 100ng 消减 DNA 至少 107cpm)。确保每种探针的特异活性都大致相等。

b. 将探针煮沸 5 min，然后在冰上冷却。

c. 将探针加到预杂交液中。

5.72°C 振荡杂交过夜。

6. 配制低严格性（2XSSC,5 g/LSDS) 和高严格性（0.2XSSC,5 g/LSDS) 洗涤缓冲液，并加热到 68°C。

7. 依次用低严格性缓冲液（4X20 min，68°C) 和高严格性缓冲液（2X20 min，68°C)洗膜。

8. 进行放射性自显影。

9. 如果需要，在 5 g/LSDS 中煮沸 7 min, 可以除去探针。

印迹一般可以重复使用至少 5 次。

为了将杂交背景降到最低，不使用时应将旗放在 SaranWrap 中，-20°C 保存。