全国生物医药色谱会分会报告集锦（一）
2012年4月21日下午，全国生物医药色谱及相关技术学术交流会各分会在美丽的重庆大学虎溪校区陆续展开。以下是“生化与医药分会”的精彩内容，来自各著名高校、研究院所的专家、老师，就色谱新技术、新观念以及在药品、蛋白质、天然产物等分析、分离方面的应用进行了深入的交流。
分会现场
浙江大学 潘远江教授
首先来自著名高校浙江大学的潘远江教授就“新型逆流色谱技术及其在天然来源有效成分分离中的应用”做了精彩报告。
潘教授简单介绍了高效逆流色谱技术的概念和特点。
高速逆流色谱技术（High-speed CCC），在天然产物有效成分的制备性分离中显示出其众多优势：
①由于不采用固体支撑介质，因而避免了样品的不可逆吸附和样品的化学变性；
②特别适合分离高极性稳定性差的物质；
③分离过程灵活，洗脱方式简单；
④根据需要，可分离从几毫克到十几克不等样品。
为拓展逆流色谱应用天然产物有效成分的分离研究，潘教授开展了以下的方法研究：
1）基于天然活性物质的快速、高通量逆流色谱筛选方法
潘教授采用 “洗脱/推出”技术与两柱体积法相结合的方式进行逆流色谱两相溶剂体系的筛选。通过基本色谱公式推算出洗脱体积、被分离物质的分配系数以及分辨率三者之间的关系，进而从理论上预测出逆流色谱分离效能。
自行设计并研制了一种新型多通道逆流色谱仪，可快速、高通量、准确的筛选出适用于如天然产物粗提物的两相溶剂体系。
2）“反推”（Back-Extrusion）技术为核心的逆流色谱方法
该方法首先采用常规的逆流色谱洗脱方式，待具有较小和中等分配系数的被分离物质洗脱出色谱柱后，在保持色谱原来的流动相的前提下，通过一个转换阀方便的改变逆流色谱的洗脱方式（即首端和尾端），从而将极易保留在固定相中的样品迅速的从色谱柱的首端“推出”。该方法充分利用了逆流色谱的固定相和流动相都是液体的特性，提高了逆流色谱的极性区间，分离效率，缩短了分离时间，减少了有机溶剂消耗。方法操作简便，可采用正相和反相两种模式，可广泛应用于天然产物和生物分子的分析和分离制备等领域。
3）二维逆流色谱接口技术的研究及其应用
为了切实提高逆流色谱的分离制备性能并将该技术有效的应用在复杂体系（如天然产物）的快速分离中，发展并建立有效的二维逆流色谱分离方法。考虑到多维色谱的制备性能以及提高第二维色谱的分离能力，设计了一套在线浓缩装置来避免第一维大体积样品的收集，在确保色谱系统制备性能的同时，避免不同溶剂体系对第二维色谱溶剂体系的干扰。将第二维样品的采集、在线浓缩以及一维/二维的切换在一个两位置、多通道的阀系统上完成。对于第二维样品的采集与一维/二维的切换，拟通过阀系统的转换来完成。
来自日立高新技术公司分析部的牟晓丽以“心系药品质量，共享健康生活”的主题介绍了日立液相色谱产品以及其在药品分析中的应用。
介绍说目前在中国市场上日立的液相色谱产品主要有Chromaster、LaChrom Elite常规高效液相色谱，LaChrom Ultra超高效液相色谱，还有氨基酸分析专用仪L-8900。“为用户提供更好的产品来得到更好的实验结果”一直是日立公司不断的追求的目标。
日立液相色谱在药品方面的应用涵盖了西药、生物药品和中药。重点介绍了Chromaster在药物检测方面的应用实例。包括双波长检测分析阿司匹林制剂中的分解产物、类固醇药物的分析、抗真菌药的分析、血清中苯妥英的分析、氯唑沙宗及其代谢产物的分析、睾酮及其代谢物的同时分析、生物药品的分析（肽图法）等。具体介绍了各应用实例的样品前处理、色谱柱选择、流动相、流速、进样量、柱温、检测波长等检测条件。
北京理化分析测试技术学会 武杰教授
来自北京市科学技术研究院、北京理化分析测试技术学会武杰教授带来了一个新概念“色谱分析应用包”。以“色谱分析应用包”的创新与研发为题作了报告。分为三个部分：概念、应用包组成模块、研发难点与前景。
1.概念：
色谱仪器 + 色谱分析应用包 = 整体解决方案
色谱仪器包括气相色谱仪、液相色谱仪、离子色谱仪等,主要用来完成各应用领域实际分析使用,而仪器制造厂商尤其是国产色谱仪厂商缺少强大分析应用技术力量,不能满足不同领域用户实际分析需求是限制国产仪器推广的主要原因。“色谱分析应用包”就是将具体分析应用技术形成一种产品来支持色谱仪器更好推广应用。
2.“色谱分析应用包”基本模块：
①色谱仪器种类与仪器基本配置要求；
②仪器实验条件技术参数；
③色谱柱及相关技术指标；
④标准样品与标准色谱图；
⑤定性方法、定量方法操作技术；
⑥准确度与精密度实验方法；
⑦样品前处理仪器与实验方法；
⑧其他辅助仪器与对应标准方法；
3.研发难点与应用前景：
在研发初期应选择应用最广泛、社会最需求的项目。研发人员需是对应行业色谱分析的“高手”以保证“ 色谱分析应用包”技术的先进性，。采用“视频”技术等介绍如何进样，如何安装色谱柱，将详细的分析技术描述做成光盘，使初学者快速熟悉产品进行分析工作。
重庆工商大学环境与生物工程学院 沈荣教授
来自重庆工商大学环境与生物工程学院的沈荣教授带来了题为“高效液相色谱的4种国产商品手性柱对65种药物的拆分研究”的报告。
沈教授介绍说采用正相、反相和极性有机相3种分离模式，利用4种国产商品手性柱对65种药物进行手性拆分。4种手性柱固定相分别是纤维素-三( 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷型手性固定相( Sino-ChiralOD)、直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) 涂敷型手性固定相（Sino-Chiral○R○R○RAS）和纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）固定相（Sino-ChiralAD柱）、直链淀粉-三（S）-α-甲基苄基氨基甲酸酯固定相（Sino-Chiral○ROJ），手性柱选择顺序依次为OD-AD-AS-OJ。65种药物包括手性药物合成中的重要中间体和手性拆分剂、治疗心脑血管疾病的β-手提阻断药、抑制胃酸的药、抗高血压药物、农药等等。结果表明，65种药物均获得良好分离，其中2种通用型的OD柱和AD柱手性识别率达94%，4种固定相的手性识别性能具有一定的互补性。
来自中国科学院生态环境研究中心的尹俊发研究员带来了题为“分子印迹纳米材料用于BPDE-DNA加合物的高灵敏检测”的报告
尹教授介绍说外源性环境污染物可能引起细胞DNA损伤，并进一步导致癌症等疾病的发生。然而，从大量正常DNA中筛查出痕量的DNA损伤产物却并非易事。尹教授在研究中将分子印迹聚合物（MIP）作为人工抗体替代DNA加合物的天然抗体，并用于致癌物苯并芘暴露引起的BPDE-DNA加合物的高灵敏检测。
利用原子转移自由基聚合技术（ATRP）在磁性纳米颗粒上构建了具有单链DNA携带和识别功能的MIP复合磁性纳米材料。构建的MIP聚合物层在5-60 nm间可控，可方便地通过磁场进行捕获分离。为获得对BPDE-DNA加合物的特异选择性，设计了两类新型功能单体，使其对靶分子的识别亲合力达到900 nM。将MIP复合磁性纳米材料作为人工塑料抗体，可选择性俘获细胞基因组DNA中痕量的BPDE-DNA加合物。BPDE-DNA加合物被MIP纳米材料俘获以后，经过荧光染色、激光扫描共聚焦荧光显微成像、荧光计数等步骤来进行定量分析，方法对BPDE-DNA加合物的检测灵敏度可达18 pM。
最后说这种方法可望用于细胞中BPDE-DNA加合物的检测以及多环芳烃类污染物（PAHs）引起肿瘤的早期诊断。
广东药学院 张红武研究员
来自广东药学院的张红武研究员介绍了聚合物整体柱用于体内药物分离的应用研究。分为两部分：
一是移液器吸液管合物整体柱固相萃取血液中的中药活性单体黄酮成分——甘草素。以雄性大鼠，用藿香正气水4mL灌胃，取眼眶静脉血1.8mL,3倍甲醇处理，高速离心后收集上血清，氮气流浓缩至干，800μL甲醇溶解上样检测。结果表明利用移液器吸液管整体柱的混合模式作用力，可以有效富集血样中的甘草素。
二是以三聚氰胺为类模板的分子印迹聚合物整体柱对模板分子结构类似物的识别。MIP应用中常遇到，模板分子泄漏，难溶于聚合体系等问题。通过制备MIP整体柱并测定人血清样中的TMP、MTX，与NIP柱的测量结果比较对照。表明以三聚氰胺为类模板的分子印迹聚合物整体柱具有选择性识别TMP、MTX的能力可以此MIP整体柱选择性富集TMP和MTX。
北京理工大学生命学院 周晓玫
来自北京理工大学生命学院的周晓玫以“毛细管电泳法表征评价合成的寡核苷酸样品”为题作了介绍。
报告中提到，建立毛细管电泳表征评价人工合成的寡核苷酸样品的质量方法，研究核酸样品处理和保存条件的影响对于核酸相关分析的后续实验至关重要。
目前对人工合成ss-DNA样品的质量评价可以采用传统方法的琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。这些方法的局限性是操作复杂、耗时长、灵敏度低、样品消耗量大。而采用毛细管电泳方法检测寡核苷酸，方法简便、快速、直观、可由峰高及出峰时间判断样品含量、纯度、稳定性和均一性。
在研究中采用毛细管区带电泳法结合紫外检测器，对两个生产厂家、两种纯化方法合成的数种序列组成不同的ss-DNA进行比较。结果表明，不同生产厂家合成的的ss-DNA样品，其毛细管电泳表征结果差异较大，因此实验之前应进行质量评价。
军事医学科学院二所北京蛋白质组研究中心 张养军研究员
经过短暂的休息之后报告继续进行。军事医学科学院二所北京蛋白质组研究中心张养军研究员介绍了“聚合物覆盖的磁性纳米颗粒上胰蛋白酶反应器的制备及其用于快速、高效蛋白质酶切、18O标记和蛋白质定量”的研究内容。
张研究员介绍说表面固定胰蛋白酶的聚合物覆盖磁性纳米颗粒方法，首先是在硅胶纳米球表面覆盖一层Fe3O4制备磁性纳米材料，然后通过表面引发的原子自由基聚合反应修饰一层聚合物（PHMN)），再通过毛发状聚合物侧链上的环氧基转化形成醛基与乙二胺结合，最后在胰蛋白酶、碳酸氢铵和硼氰酸钠溶液中，通过戊二醛将胰蛋白酶固定于磁性纳米颗粒的表面，制备出固定化胰蛋白酶反应器（PHMN-Trypsin）。并进行酶切、标记等实验。
此研究建立了一种PHMN-Trypsin酶切及18O标记偶联MRM技术的质谱新定量方法，成功将PHMN-Trypsin应用于目标蛋白在复杂样本体系绝对定量。
来自中国科学院化学研究所齐莉博士带来了题为“基于肾缺血的酶反应及酶抑制剂筛选的CLE-CE研究”的报告。
1.基于肾缺血的酶反应CLE-CE研究
以锌-L-丙氨酰胺络合物为手性选择剂，采用CLE-CE新方法来分析酶底物的浓度变化进而实现了对DAAO活性的研究。研究结果显示：小鼠体内急性肾缺血1小时后，其肾部DAAO 的活性会大幅降低。齐博士认为这种急性肾损伤所导致的肾局部DAAO活性降低的现象可能与体内代谢酸中毒有关，同时这也为肾缺血过程中ROS的变化提供了新的研究思路。
2.酶抑制剂筛选的CLE-CE研究
以锌-L-脯氨酰胺络合物为手性选择剂，建立了一种分析DAAO酶抑制剂的CLE-CE新方法，开展了酶活性竞争性抑制过程中的动力学研究，以所获得的S型抑制曲线，对数种酶抑制剂的酶活性抑制效率进行了筛选。
中南民族大学生命科学学院 察冬梅
来自中南民族大学生命科学学院察冬梅老师带来了“碱性品红修饰磁性微球的制备及其在分枝杆菌分离中的应用初探”的报告。
察老师介绍说，控制结核病（tuberculosis，TB）的关键在于早期诊断。痰或其它各种体液内MTB阳性是诊断TB的金标准。
察老师曾采用直接SPME-涂层中衍生化与GC-MS联用的方法，结果表明该方法的灵敏度比涂片法要高，同时所需时间远低于培养法，初步证明这种不经培养直接检测痰等样中MTB的方法是可行的，但方法的灵敏度和选择性仍不能满足要求，若在SPME前将样品中可能存在的MTB从样品中分离出来，则可大大提高后续萃取分析的信噪比。
MTB和其它细菌在细胞壁结构及对染料的亲和力方面存在较大差异，据此察老师在磁性微球上键合这种对MTB有选择性的染料，利用染料和MTB之间的作用力，借微球大的比表面积和磁性，将MTB和其它细菌分离。
最后介绍说多种微生物共存时分离条件的优化、以及具体分离机理的探讨等有待进一步详细研究。
来自武汉大学药学院陈琴华教授以“中药活性成分的LC/CE-IT-MS分析新方法研究”为题作了报告。
陈教授介绍说若要对复杂的中药活性成分进行分析，需利用LC或CE与IT-MS联用技术，实现中药活性成分的鉴定和定量测定。报告中介绍了以下实验：
1.建立LC-IT-MS定性分析和定量测定同分异构体熊果酸和齐墩果酸的方法
采用熊果酸和齐墩果酸对照品直接进样，在正离子和负离子模式下进行IT-MS分析，研究它们的主要碎片离子裂解途径，确定了熊果酸和齐墩果酸的定量监测离子。该方法的检测限为5 ng/mL，并成功的利用该方法测定了9种中药中熊果酸和齐墩果酸的含量。
2.建立CE-MS同时测定长春碱和长春质碱和文多灵的新方法
以20mM乙酸铵-1.5%乙酸的水溶液为缓冲液，3种化合物在20分钟以内到达基线分离，在正离子模式下，选择化合物的[M+H]+为定量监测离子，并成功利用CE-MS测定了长春花中3种活性生物碱。
中科院兰州化物所 陈小芬
最后来自中科院兰州化物所陈小芬以“HSCCC技术在分离制备天然产物中有效成分中的应用”为题作报告。
介绍说，近年来高速逆流色谱（HSCCC）技术在与提取以及检测技术的联用，在线或离线筛选活性成分的研究方面取得了不断的进步。研究中采用HSCCC-HPLC-DPPH 联用技术，实现对橄榄叶中活性物质的筛选和分离；利用HSCCC技术分离纯化迷果芹中热不稳定以及大极性物质，并得到两个新化合物；发展了高剪切提取技术（HSDE）与HSCCC的在线联用，实现了对油菜花粉中大极性物质进行快速、高效的分离制备。
