聚丙烯酰胺凝胶电泳仪分析技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的电泳技术，于1959年建立，1964年进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于分辨率高，目前已广泛用于蛋白质等生物大分子的分析。
一、PAGE工作原理：
聚丙烯酰胺凝胶具有高粘度和高摩擦阻力，电泳过程中能防止对流，把扩散减到最小。凝胶具有多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，能产生分子筛效应，其分离既与电荷密度有关，又与分子大小有关，对分离不同相对分子量的生物大分子极为有利。
二、PAGE载体特性：
采用聚丙烯酰胺凝胶作为载体的目是防止电泳过程中分子的对流和扩散，使待测组分得到更有效的分离。载体应具备以下特性：
1、物理化学性质稳定，在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。
2、化学惰性，在电泳过程中不与缓冲液中的离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。
3、分布均匀，电渗小，结果重复性好。
三、聚丙烯酰胺凝胶合成方式：
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（CH2 = CH－CO－NH2，简称Acr）和交联剂N，N′－甲叉双丙烯酰胺（CH2 = CH－CO－NH－CO－CH = CH2，简称Bis）在催化剂作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成不带电荷且具有分子筛性质的三维网状结构凝胶。参与反应的催化剂有两种成分，一种是引发剂，提供原始自由基，通过自由基传递，使单体Acr成为自由基，引发聚合反应；另一种是加速剂，加快引发剂释放自由基的速度。
聚丙烯酰胺凝胶的合成是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原反应来完成，催化体系的实质是自由基催化的氧化还原过程。聚丙烯酰胺凝胶合成方式有化学聚合和光聚合。
1、化学聚合：
（1）原理：
引发剂过硫酸铵（AP）在加速剂N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）的催化下形成游离氧自由基，即S2O82ˉ→ 2SO4ˉ，硫酸自由基的氧原子激活单体Acr形成单体长链，交联剂Bis将单体长链间连成三维网状结构。
Acr和Bis决定孔径大小，AP和TEMED决定聚合速度。
（2）影响化学聚合的因素：
1）引发剂和加速剂的浓度：
引发剂和加速剂的浓度小，聚合速度慢。浓度过大，易导致电泳时烧胶和区带畸变。
一般使聚合过程在40～60min内完成。
2）系统pH：
在碱性pH时，聚合速度快。在酸性条件时，同样浓度的溶液，聚合速度慢。
存在一个最优pH，以获得最优聚合结果。
3）温度：
温度高，聚合速度快。温度低，聚合速度慢。
低温聚合时，凝胶会变得脆而浑浊，重复性差。在25℃聚合的凝胶，较透明，有弹性。
4）分子氧：
分子氧能使AP分解，导致自由基淬灭，阻止多聚体链长的增加。
进行化学聚合时，反应液应与空气隔绝。
5）系统纯度：
有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃和一些金属等会抑制聚合反应，反应液和容器表面接触的一层不能形成凝胶。
某些化学物质可减慢聚合速度。
（3）应用：
PAGE的分离胶（小孔胶）是通过化学聚合法制备而成。
2、光聚合：
（1）原理：
引发剂核黄素在加速剂TEMED和光照条件下，分解成无色的还原型（无色核黄素），在少量O2条件下，还原型核黄素被O2再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。
（2）影响光聚合的因素：
1）需痕量氧原子存在，但过量的氧会阻止链长的增加。
2）核黄素用量少（4mg/100mL），生物样品不失活。
3）光源容易获取，改变光照量可控制聚合时间。光照量不易掌握，使凝胶孔径不稳定。
（3）应用：
光聚合的凝胶孔径大，适于制备PAGE的浓缩胶（大孔胶）。
四、聚丙烯酰胺凝胶性能指标：
1、性能指标：
聚丙烯酰胺凝胶性能指标有凝胶总浓度和交联度等。
（1）凝胶总浓度（T）：
凝胶总浓度表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含量。
T = [（a + b）/m]×100%
式中：a为单体Acr的质量（g），b为交联剂Bis的质量（g），m为溶液的体积（mL）。
凝胶总浓度主要影响凝胶筛孔大小。凝胶平均孔径随着凝胶总浓度的增大而减小。
实验表明，凝胶筛孔的平均直径和凝胶总浓度的平方根成反比。即：
D＝kd/（T1/2）
式中：D为凝胶筛孔的平均直径，d为多聚体分子直径，k为常数。
凝胶总浓度可在3%～30%之间变化。凝胶总浓度过高，凝胶硬而脆，易破碎。凝胶总浓度过低，凝胶稀软，不易操作。
（2）交联度（C）：
交联度表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分含量。
C = [b/（a + b）]×100%
交联度决定凝胶筛孔的最大直径。交联度过高，凝胶不透明，缺乏弹性。交联度过低，呈糊状。要获得透明而有合适机械强度的凝胶，单体用量高时，交联剂量应减少；单体用量低时，交联剂量应增大。
a和b的比例很重要，决定凝胶的物理性质。
当a/b＜10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色。
当a/b≈30且T = 3%时，凝胶富有弹性，完全透明。
当a/b≥100时，即使5%的凝胶也呈糊状。
当a＜2%和b＜0.5%时，凝胶不能聚合。
2、良好凝胶的经验公式：
在100mL溶液中，Acr（g）×Bis（g）≈1.3
最常用凝胶的组成是T＝7%～7.5%，C＝2%～3%。
标准凝胶的组成是T＝7.2%，C＝2.6%，可较好分离蛋白质。
当分析未知样品时，常用标准凝胶或4%～10%的梯度凝胶试测，然后确定合适的凝胶总浓度。
3、凝胶总浓度和交联度与凝胶孔径的关系：
聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于凝胶总浓度和交联度。
凝胶总浓度和交联度与凝胶平均孔径的关系如下：
（1）凝胶总浓度为6.5%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为2.4nm
2）交联度为5%时，平均孔径为1.9nm
3）交联度为15%时，平均孔径为2.8nm
（2）凝胶总浓度为8%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为2.3nm
2）交联度为5%时，平均孔径为1.6nm
3）交联度为15%时，平均孔径为2.4nm
4）交联度为25%时，平均孔径为3.6nm
（3）凝胶总浓度为10%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为1.9nm
2）交联度为5%时，平均孔径为1.4nm
3）交联度为15%时，平均孔径为2nm
4）交联度为25%时，平均孔径为3nm
（4）凝胶总浓度为12%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为1.7nm
2）交联度为5%时，平均孔径为0.9nm
（5）凝胶总浓度为15%时：
1）交联度为1%时，平均孔径为1.4nm
2）交联度为5%时，平均孔径为0.7nm
当凝胶总浓度＜2.5%时，可筛分相对分子量＞106的大分子。
当凝胶总浓度＞30%时，可筛分相对分子量＜2000的多肽。
当交联度为5%时，凝胶平均孔径在各凝胶总浓度时均最小。
4、凝胶的分子筛效应：
凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，分子筛效应的大小取决于凝胶孔径大小与生物大分子大小的接近程度。凝胶总浓度不同，平均孔径不同，不同大小和形状的大分子通过筛孔时受到的阻力不同，加上大分子的电荷效应，使迁移率不同的大分子得以分离。
（1）蛋白质相对分子量与凝胶总浓度的关系：
1）蛋白质相对分子量范围：＜1×104
适用的凝胶总浓度：20%～30%
2）蛋白质相对分子量范围：1×104～4×104
适用的凝胶总浓度：15%～20%
3）蛋白质相对分子量范围：4×104～1×105
适用的凝胶总浓度：10%～15%
4）蛋白质相对分子量范围：1×105～5×105
适用的凝胶总浓度：5%～10%
5）蛋白质相对分子量范围：＞5×105
适用的凝胶总浓度：2%～5%
（2）核酸相对分子量与凝胶总浓度的关系：
1）核酸相对分子量范围：＜1×104
适用的凝胶总浓度：15%～20%
2）核酸相对分子量范围：1×104～1×105
适用的凝胶总浓度：5%～10%
3）核酸相对分子量范围：1×105～2×106
适用的凝胶总浓度：2%～2.6%
用于大分子核酸研究的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，凝胶太软，几乎是液体，不易操作，可加入0.5%琼脂糖或在3%凝胶中加入20%蔗糖，以增加机械强度而又不影响凝胶筛孔大小。
五、PAGE特点：
1、优点：
（1）凝胶孔径与生物大分子大小具有相似的数量级，具有良好的分子筛效应。
（2）根据待分离大分子的相对分子量，通过改变凝胶总浓度和交联度可调节凝胶孔径，使大分子得到较好分离。
（3）在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械强度好。
（4）凝胶是由－C－C－C－C－结合的酰胺类多聚物，侧链上具有不活泼的酰胺基，没有其它带电基团，无吸附，几乎无电渗作用。
（5）化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶，凝胶杂质少，不污染样品，与生物大分子不发生化学反应，样品分离后仍然保持生物活性。
（6）可按需要把带有一定电荷的基团作为共聚体渗入其中。
（7）电泳过程中对温度和pH变化小。
（8）抗对流性好，散热性好，样品不易扩散。
（9）把分子筛效应和电荷效应结合在同一方法中，可达到更高的分离度。尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩效应、分子筛效应和电荷效应为一体，分离度极高。
（10）只要Acr纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果具有很好的重复性。
（11）柱效极高，灵敏度高，分离时间短。
（12）需要样品量少，1～100μg足够。
2、缺点：
（1）凝胶制备较困难，使用寿命短。
（2）进样端易堵，若有气泡则难以除去，影响分离。
六、连续PAGE：
连续PAGE是在整个电泳体系中采用的凝胶孔径、缓冲液离子组成和缓冲液pH都相同，电泳时仅具有分子筛效应和电荷效应。具有以下特点：
1、制胶简单快捷。
2、缓冲液pH值恒定，可防止样品进入凝胶后因pH值改变而发生凝聚和沉淀。
3、缓冲液离子组成简单，来源广泛。
4、分辨率不高。
七、不连续PAGE：
不连续PAGE采用两种以上的凝胶孔径、缓冲液离子组成和缓冲液pH，使凝胶孔径、缓冲液离子组成、缓冲液pH和电位梯度具有不连续性，电泳时存在样品的浓缩效应、凝胶的分子筛效应和电荷效应，使样品分离效果好，分辨率高，适用于复杂和特殊样品的分离。其中不连续PAGE的盘状凝胶电泳最为常用。
1、盘状凝胶电泳组成：
（1）凝胶层：
1）样品胶：T = 3.1%，C = 20%
2）浓缩胶：T = 3.1%，C = 20%
3）分离胶：T = 7.2%，C = 2.6%
（2）缓冲液离子组成和pH：
1）电极缓冲液：pH = 8.3的Tris－甘氨酸缓冲液
2）样品胶缓冲液：pH = 6.8的Tris－HCl缓冲液
3）浓缩胶缓冲液：pH = 6.8的Tris－HCl缓冲液
4）分离胶缓冲液：pH = 8.9的Tris－HCl缓冲液
（3）电位梯度：
在电场中自然形成不连续的电位梯度。
2、三大效应：
在盘状凝胶电泳的不连续体系中，存在样品的浓缩效应、凝胶的分子筛效应和电荷效应三大效应。
（1）浓缩效应：
1）凝胶层的不连续性：
①样品胶：为大孔胶，采用光聚合法制备。样品预先加在其中，起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。目前电泳一般不制作此胶。
②浓缩胶：为大孔胶，采用光聚合法制备。起防止对流的作用，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面处浓缩成薄层。
③分离胶：为小孔胶，采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离，起防止对流的作用。蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时受到的阻力大，移动速度减慢。由于凝胶层的不连续性，在浓缩胶与分离胶的界面处使样品浓缩，区带变窄。
2）缓冲液离子组成的不连续性：
在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向移动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则跑在前面的离子称为快离子（前导离子），跑在后面的离子称为慢离子（尾随离子）。为了使样品达到浓缩的目的，需在缓冲液中加入有效迁移率不同的两种离子，并使这两种离子在缓冲液中组成不连续的两相，即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。为了保持溶液的电中性和一定的pH值，需加入一种与快、慢离子电荷符号相反的离子，称为缓冲配对离子，使缓冲配对离子分布于全部缓冲液中，即三层凝胶缓冲液和电极缓冲液中。
如分离蛋白质时，通常采用氯离子（Clˉ）为快离子，甘氨酸根离子（(NH2CH2COOˉ）为慢离子，三羟甲基氨基甲烷（Tris+）为缓冲配对离子。
电泳开始前，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布于三层凝胶中，样品在样品胶中，缓冲配对离子分布于全部缓冲液中。电泳进行时，快离子与慢离子的界面向下移动。由于选择适当的pH值缓冲液，使蛋白质的有效迁移率介于快、慢离子之间，而浓缩成为极窄的区带。当样品到达浓缩胶与分离胶的界面处时，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后被分成多个区带。
3）缓冲液pH的不连续性：
在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子比所有被分离样品的有效迁移率都低，使样品夹在快离子与慢离子的界面之间被浓缩。而在分离胶中，慢离子的有效迁移率比所有被分离样品的有效迁移率都高，使样品不再受离子界面的影响。
电极缓冲液pH = 8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小。浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大。蛋白质在浓缩胶中介于快、慢离子之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一低电导区，产生高电位梯度，使甘氨酸根离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间被压缩。
4）电位梯度的不连续性：
在不连续体系中，电位梯度的差异是自然形成的。电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，会很快超过蛋白质，在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。由于电导与电位梯度成反比，低电导区的电位梯度较高。高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质的有效迁移率与电位梯度的乘积分别相等时，则三种离子的移动速度相同。快、慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，在快、慢离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面，即在高、低电位梯度区之间形成一个迅速移动的界面，由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此就聚焦在这个移动的界面附近，被浓缩成一个狭小的中间层。
（2）分子筛效应：
离子界面到达浓缩胶与分离胶的界面处时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，有效迁移率超过蛋白质，随之高电位梯度消失，蛋白质在均一的电位梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶。当蛋白质的相对分子量和构象不同时，通过分离胶所受到的阻力不同，因迁移率不同而被分开。凝胶这种分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力，这种现象称为分子筛效应。
（3）电荷效应：
蛋白质在浓缩胶与分离胶的界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，移动速度快，反之则慢。因此各蛋白质以一定的顺序排列成多个圆盘状。
综上所述，样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行，分子筛效应和电荷效应主要是在分离胶中进行。在蛋白质进入分离胶时，由于在浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面，高电位梯度消失，使蛋白质进入均一的电位梯度和pH的分离胶中。此时，又由于分离胶的孔径小，各蛋白质因分子大小和形状不同而被阻滞的程度不同，使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛效应不同而得到分离。
八、PAGE电泳前准备工作：
1、缓冲液的选择：
（1）缓冲液的选择要求：
保证蛋白质的溶解性、稳定性和生物活性。
从理论上讲，PAGE可在任何pH条件下进行，但实际上在过酸或过碱条件下，将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pH应选择在3～10之间。
（2）缓冲液的选择原则：
如果缓冲液pH选择在远离蛋白质的等电点，则蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短，区带细而窄。
如果缓冲液pH选择在靠近一种或几种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率高。
缓冲液pH常选择在8～9.5之间。
常用缓冲液有Tris－甘氨酸（pH = 8.3～9.5），Tris－硼酸（pH = 8.3～9.3）和Tris－醋酸（pH = 7.2～8.5）等。
2、离子强度的选择：
离子强度既要起到缓冲作用，又要产生的焦耳热少。一般选用较低的离子强度。
一般选择缓冲液的离子强度为0.01～0.1mol/L。
3、凝胶总浓度的选择：
由于PAGE分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质分子大小和形状，因此与凝胶的分子筛效应密切相关。
根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，凝胶可分为：
（1）排阻性凝胶：凝胶总浓度大于1%的聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
（2）非排阻性凝胶：凝胶总浓度为0.7%～1%的琼脂糖凝胶。
凝胶总浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置。
凝胶总浓度太小，孔径太大，样品中各蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离。
九、PAGE注意事项：
1、避免吸入、皮肤接触Acr和Bis试剂。
2、制胶时要充分摇匀，最后加TEMED。
3、Acr和Bis要避光保存。
4、混合溶液的保存不宜超过一个月。
5、固体胶切忌倒入水池。
6、玻璃管表面应光滑洁净，用蔗糖溶液封住管底，否则会造成凝胶与玻璃管之间产生气泡。
7、尽量不要破坏胶面，否则样品区带不平整。
十、PAGE应用：
广泛用于蛋白质和较小分子核酸的分离。
