由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
| 实验方法原理 | 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。 |
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| 实验材料 | 噬菌体 T4 DNA 连接酶PCR 扩增的靶 DNAT 载体 |
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| 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶水浴箱 |
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| 实验步骤 | 一、材料
1. 酶与缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
2. 凝胶
琼脂糖凝胶
3. 核苷酸与寡核苷酸
PCR 扩增的靶 DNA ( 25 μg/ml)
4. 载体
T 载体
5. 特殊设备
预设水温在 14℃ 的水浴箱
二、方法
1. 在一只微量离心管内，依次加入下列连接混合液：
25 μg/ml 扩增靶序列 DNA 1 μl
T 质粒 20 ng
10X 连接缓冲液 1 μl
噬菌体 T4 DNA 连接酶 3 单位
H2O 补足至 10 μl
2. 将连接混合液在 14℃ 温育 4 h。
3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl，用 10 μl H2O 稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布在含有合适抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。
4. 计算实验组与对照组在培养皿上的菌落数。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定；也可以直接用菌落 PCR 予以鉴定。
5. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆 DNA 片段的大小（采用合适的 DNA marker分子量作对照）。
6. 利用 DNA 序列分析，限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。 |
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