蛋白质的抽提实验——超声波破碎法
蛋白质的抽提实验是进行蛋白质实验分析的基本操作，可用于（1）蛋白质的分离（2）蛋白质功能结构检测（3）蛋白质表达前的基本操作。
| 实验方法原理 | 蛋白质在细菌中表现后，以反复的冷冻-解冻方法打破细胞，再用硫酸铵把蛋白质沉淀下来，此步骤可以去除大部份核酸、多醣、脂质等杂物。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 挑取培养皿上单一菌落，培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中，以120 rpm 转速震荡，在37℃下培养过夜。 2. 取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中，以120 rpm 37℃培养至A600 = 0.6 后，加入IPTG成为1 mM浓度，继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h。 3. 将菌液倒入50 mL 离心管 （conical tube） 中离心10 min （5 000 rpm）。 4. 倒去上清，可将菌块连同离心管置 -20℃冰箱贮存。 5. 取出含菌块的离心管置碎冰上，待菌块溶解后，以残存液体均匀悬浊的。再加入10 mL lysis buffer 轻轻悬浮的。 6. 将菌液放在液态氮中冷冻1 min,然后在37℃水浴中摇荡溶解的。如此反复三次，尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入50 mL 高速离心机的离心管内。 7. 离心20 min （12 000 rpm，4℃） 取上清共 _____ mL，称为 粗抽取液 （XT）；预留100 μL 以便日后一起进行分析。此后样本均得放置碎冰上，以低温进行实验。 8. 此上清加入5 mL buffer A-0 混匀后倒入烧杯，置碎冰上放冷，不时搅拌并缓缓加入固体硫酸铵 _____ gm,使成为70%饱和度，加完后再搅拌10 min。 9. 离心20 min （12 000 rpm，4℃） 后小心倒去上清，取白色沉淀部份。 10. 沉淀加以2 mL buffer A-150 均匀悬浊的，再以桌上型离心机去除不溶物质，（10 000 rpm，5 min），共得 ______ mL，称为 全蛋白质 （TP）；预留100 uL,连同上述XT 置4℃冷藏。 11. 其余溶液部份准备进行胶体过滤层析，标示清楚后置4℃冷藏。 展开 |
| 注意事项 | 1. 操作时总是小体积小量的操作，避免污染，并且动作要快。 2. 蛋白酶普遍存在，在提取蛋白质的步骤中，早些抑制，经常抑制。 3. 分装蛋白溶液，储存于不同的温度和不同的缓冲液中，测蛋白活性，找出最适储存条件。 4. 冷藏，并加入稳定剂。这些稳定剂一般都能充分保持蛋白的生物学活性。 5. 避免酶的反复冻融，如果酶需要冻存，分装成小管后冻存。 展开 |
| 其他 |
1、仪器用具 2、药品试剂 β-mercaptoethanol，25 ug/mL PMSF，40 ug/mL lysozyme.Buffer A-0 （50 mM Na3PO4， pH7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成为10 mM 最终浓度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl；硫酸铵（要烘干并以研砵磨碎）。 3、蛋白质的储存：
（2）整个实验过程中，都要将蛋白样品置于冰上。 （3）从母管中吸取不同的蛋白时，都要用新鲜的枪头。 （4）不要将未用的溶液倒回母管。 （5）戴手套操作，避免蛋白交叉污染，或是蛋白酶的污染。 （6）避免剧烈的震荡，避免溶液中混入蛋白变性剂。 （7）实验的过程中应避免灰尘进入，灰尘包含60%的肌氨酸。 展开 |
