反向PCR （inverse-PCR）
| 实验方法原理 |
反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA样品 |
| 试剂、试剂盒 | T4 DNA连接酶（T4 DNALigase） 引物 EcoR I ddH2O 酚 氯仿 无水乙醇 乙酸钠 |
| 仪器、耗材 | 电泳仪 离心管 离心机 超净台 水浴锅 |
| 实验步骤 |
一、限制性内切酶消化 1. 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。 2. 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下： 1. 将酶切产物转到1.5 ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250 ul； 2. 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1 min； 3. 最大速度（13 000 rpm）离心1 min； 4. 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1 min； 5. 最大速度（13 000 rpm）离心2 min； 6. 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3 M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5 min； 7. 4℃最大速度（13 000 rpm）离心10~15 min； 8. 弃上清，尽量除去管壁上的液体； 9. 加入1 ml -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13 000 rpm）离心5 min； 10. 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40 ul ddH2O溶解。-20℃保存。 三、连接 2-14℃ 过夜 2. 连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等（2002）的方法（12-14℃连接48 h）。连接完成后，65℃ 水浴10 min灭活。按上述3.抽提回收，溶解于40 ul ddH2O中。
3. 然后就可以用回收的链接片段做PCR了。
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| 注意事项 |
1. 需要从许多酶中选择合适限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。 2. 基因组DNA必须酶切完全。 3. 为提高分子间连接的效率，连接反应中DNA的浓度要低，因为高浓度的DNA可能会提高非同源连接水平，从而产生非特异性扩增。 4. 成环的cDNA进行裂解和变性比较重要，因为环状双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应，它只可以扩增出较短的DNA片段。 5. 碱变性法已成功地用于制备PCR和测序DNA，该方法也可以有效地使环化的双链cDNA实现变性。
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