受PDCD4调节的miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN反馈环抑制鼻咽癌...
受PDCD4调节的miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN反馈环抑制鼻咽癌细胞生长与代谢
方唯意教授研究团队近日又在Oncogene上发文证实了受PDCD4调节的miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN反馈环能抑制鼻咽癌细胞生长与代谢。让我们看看这次的研究思路与结果吧。
实验思路与方法
miR-374a对NPC细胞的抑制作用
图1
与阴性对照组相比，miR-374a mimic抑制细胞生长（图1a），阻碍G1/S细胞周期过渡（图1b），还会减少细胞代谢与入侵，此外，miR-374a过表达能增强NPC细胞对DDP的化学敏感性。反之，用抑制剂敲除miR-374a后显著恢复。但是，经FACS分析检测，miR-374a不诱导细胞凋亡。随后在通过小鼠体内实验验证了上述结论（图1c）。
miR-374a与细胞信号
研究者通过实验观察到miR-374a不仅抑制pPI3K（Tyr458），pAKT（Ser473）和c-JUN表达，而且显著减少细胞周期相关基因的表达，如CCND1，c-MYC.同时，包括Snail与N-cadherin在内的间叶细胞相关基因表达也下降了，而上皮标记物E-cadherin的表达量则出现了增幅，但是细胞凋亡相关蛋白PDCD4并不受miR-374a的异常表达影响。概括来说，这些数据表明miR-374a抑制PI3K/AKT,细胞信号与EMT（Epithelial-MesenchymalTransition），但不调节NPC的细胞凋亡。
CCND1的身份与作用
通过miRwalk与RNAhybrid演算法，预测CCND1与c-MYC是miR-374a的直接靶标。用荧光素酶报告基因实验与共转染实验证明在NPC细胞中，CCND1,而不是c-MYC，是miR-374a的靶标；它还能显著减少miR-374a的表达，还增强了细胞生长，代谢与侵袭性，降低了细胞对DDP的敏感性。随后，研究者发现在CCND1被敲除后，会出现与miR-374a过度表达后观察到的现象。此外，在NPC细胞中，siRNA对c-MYC的抑制降低了pPI3K与pAKT的表达量，而CCND1的抑制诱导了miR-374a的表达。这表明CCND1通过c-MYC激活PI3K/AKT通道，但其发生机理不明确。
c-JUN：关键第四号
图3
研究者通过生物信息学推测PI3K/AKT途径通过调控c-JUN降低miR-374a表达。实验表明，减弱PI3K的磷酸化作用可减少了pAKT与c-JUN的表达（图3a）同时刺激了miR-374a的表达（图3b），而敲除c-JUN（图3c）诱导miR-374a的表达（图3d），这表明c-JUN是miR-374a的上游调控者。随后我们使用染色质免疫沉淀结合qPCR分析法发现c-JUN上调会使野生型miR-374a启动子荧光素酶活性降低，且在NPC细胞中c-JUN的抑制降低了CCND1的表达（图3c）。
PDCD4如何抑制 NPC 细胞活动？
研究者通过实验证明了在5-8F细胞中PDCD4过表达显著降低细胞迁移与侵袭性，同时降低EMT-相关基因的表达，而在PDCD4正常表达的SUNE1与HONE1细胞中观察到相反的结果。这表明PDCD4通过EMT信号抑制细胞代谢与入侵。
miR-374a：我要插脚PDCD4调节
在此研究中，他们发现并证实在shPDCD4 NPC细胞中miR-374a显著下调，且在PDCD4过表达时出现相反的影响，而c-JUN直接抑制miR-374a表达。此外还发现在PDCD4过表达的5-8F NPC细胞中，结合到miR-374a启动子上的c-JUN会显著减少。抑制miR-374a可部分恢复CCND1与pPI3K水平，同时总PI3K或PDCD4在c-JUN敲除后未出现改变。这些数据表明PDCD4通过PI3K/AKT/c-JUN途径诱导miR-374a表达。
捋捋三角关系
图4
接着，他们尝试着理清miR-374a, PDCD4与CCND1之间mRNA水平的关系。相比起正常鼻咽（NP）组织，NPC样本中的miR-374a（图4a，1）与PDCD4（图4a，3）的表达水平下降，而在癌症组织中CCND1显著下降（图4a，2）。这说明miR-374a表达与CCND1表达成负相关（图4b，1）且与PDCD4表达成正相关（图4b，2）。此外，经统计分析表明，CCND1表达与PDCD4表达呈负相关（图4b，3）。他们还做了存活分析，得出高CCND1、低PDCD4表达的患者预后性更差，反之，低CCND1、高PDCD4表达的患者存活时间更长（图4c）。
这篇文章的总体实验思路与之前的那篇文章的基本相同，综合两篇文章来看，我们不难发现miRNA在癌变过程中作为致癌基因或肿瘤抑制剂，扮演了一个举足轻重的角色。因此，了解每一个miRNA的功能及其表达图谱将会帮助我们验证它们作为诊断标志的作用并提供癌症治疗的治疗靶标。miR-374a最初是作为某些肿瘤的致癌基因被报道的，但在此文章以及其他文章报道中则有相反的结果，这说明miRNA的分子功能与基础都是极其复杂与矛盾的，不能一概而论，同时鼓励我们进行更多的研究来探索每个miRNA在特定环境中的作用。
