高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法（四）

2.3  高通量的分子标记检测

本方法制备的DNA浓度虽然低，用96针复制器加入0.5~1 µL模板进行33~35个PCR循环就可获得足够浓度的产物，并不需要加入特别多的Taq酶(甚至使用量为每45~50 µL PCR反应液1 U也能扩增分子标记)。该方法已对数万份水稻样品进行了分子标记(SSR、InDel等)检测，成功率一般可达95%以上。事实上，用微量提取法(经乙醇沉淀)粗提的基因组DNA往往由于样品间浓度差别大，定量不准确，容易加入过多的模板DNA而抑制PCR (粗提的基因组DNA也含有相当多的杂质)，因而用微量提取法粗提基因组DNA进行PCR扩增的成功率和整齐度反而不如本文介绍的方法好。图3显示若干PCR标记的实验例，扩增效果和整齐性非常好。另外，还可以在同一个反应里做2个标记的PCR扩增(图3-C)。

Fig. 3 PCR marker-based genotyping using the prepared rice seedling gDNAs as templates

A: 用SSR标记对水稻种质材料进行基因型检测。B, C: 用Indel标记对水稻分离群体进行基因型检测。2个InDel标记(M1, M2)在同一PCR反应进行基因型检测(C)。所有PCR反应是用96针复制器加入gDNA约0.5 µL，PCR条件为95℃ 2 min, 35循环的94℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 30 s. A: Genotyping of rice germplasms with a SSR marker. B, C: Genotyping of rice segregation populations with InDel markers. Two markers (M1, M2) were analyzed in the same PCRs (C).

3  讨论

已报道的各种植物DNA简易制备方法大都是用微量离心管对每个样品进行 编号、组织破碎、抽提、沉淀、干燥、溶解、定量多步骤操作，效率很低。本文的方法全过程采用96格式化操作，基因组DNA制备过程中不需要分别对每个样品进行标签和操作，非常简便快捷，通量高，且成本极低(国产96方孔板价格低，且可重复使用)。叶片采集放入96方孔板后，从加入制备溶液、震动破碎、到转移模板DNA至PCR液(不算PCR液配制)只需6~7 min。用96针复制器不会转移过量的模板DNA溶液(多通道移液器取约1 µL溶液时误差较大)，不仅快速，还节省移液头和移液头装盒的人工成本。我们用此方法已制备了10多万份水稻样品的gDNA用于PCR基因型分析，显示出此方法的高效率。本文还介绍了自制96针复制器的方法供参考（附录I）。

4  结论

本文介绍的高通量操作方法简单，效果好，省时省力，能大大提高工作效率，在基础研究和生物技术育种等领域将发挥重要作用。

References

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附录I：96针复制器制作方法

    (1) 将约6 m长1.2 mm或1.5 mm直径的#304不锈钢丝(低于#304的会生锈)拉直（一端固定在柱子上，把另一端绑在木棒上，用力拉几下）。用钢钳剪成每段45 mm。用钳夹着钢丝一端，用钢锉(较细纹的)锉平一端的端口。

    (2) 将3~4 mm厚有机玻璃板裁成80 mm  120 mm。用旧96孔PCR板沾上稀释墨水在机玻璃板印上96个点。用铁钉在每个点中心敲打出1个浅孔(目的是防止钻孔时移位)。

    (3) 对应1.2 mm或1.5 mm不锈钢丝，用稍大些直径(如1.5 mm或1.8 mm)的电钻头在96个点垂直打孔。

    (4) 用强力胶(如A、B两种胶等量混合后几分钟内硬化的强力胶)先将3根针粘结在3个角的孔中(即A1, A12, H1位置)(没有锉平的一端粘在板上，锉平端做脚底)，等强力胶固化后，将第4根粘在第4个角（即H12位置），在胶固化之前将这个“4脚桌子”脚向下放在平板上，上下微移第4根针，使4根针都接触到平板(即不翘脚)。

    (5) 将其余的针(每次同时操作2~3根)粘在剩余的小孔中(锉平端作为脚)，在胶固化之前将针调整到与2端的针同一个平面(针朝下放在平板上，使每条针都接触到板面)。

    (6) 将1块旧96孔PCR板的管底在砂布(纸)上磨至快要穿的状态，然后套在粘好的96针上，用力压下96孔PCR板使针把管底刺穿。使96孔PCR板管底留在针端位置(以便在下一步骤打磨时固定针端)。

    (7) 将复制器半成品的针端平铺在平整桌面上的砂布(砂纸)上来回移动打磨，直至将所有针端磨到同一个平面。  

    (8) 在固定96针的有机玻璃板上面再粘一块80 mm  120 mm机玻璃板(厚度不限)，上面再粘一个把手，就完成了制作。

    (9) 检测96针复制器每针取样量：往96孔PCR板每孔加入30~40 µL制备缓冲液（或水），用微量分析天平称重回零；用96针复制器沾取96孔PCR板的水1次(或将针粘取的水分擦干后再重复沾取2~3次)，再称96孔PCR板已减少的液量，算出平均每针每次的取液量。

附图1 用不锈钢丝（#304）自制的96针复制器 Supplementary Fig. 1 A home-made 96-pin replicator made from stainless steel wire