经典的 Kunfcel 寡核苷酸指导的诱变方法利用大肠杆菌中的尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (glycosylase) 特异地筛除去含尿嘧啶碱基的 DNA 的选择性作用（请参考寡核苷酸诱变信息栏）。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。
| 试剂、试剂盒 | 缓冲液和溶液乙醇氯化钠苯酚醋酸钠TE琼脂糖凝胶原始的重组 M13 噬菌体单链 DNAYT 培养基 |
|---|
| 仪器、耗材 | Corex 离心机管巴斯德滴管柱层析树脂大肠杆菌菌株 CJ236大肠杆菌菌株 TG1JM109 或相当的菌株 |
|---|
| 实验步骤 | 材料
缓冲液和溶液
各种贮存液，缓冲液和试剂成分请参阅附录 1。
将贮存液稀释至所需的浓度。
乙醇
氯化钠（2.5mol/L) 含 15% 聚乙二醇（m/V，PEG8000)
苯酚（pH8.0)
苯酚：氯仿（1:1,V/V)
醋酸钠（3mol/L,pH5.2)
TE(pH7.6)
凝胶
琼脂糖凝胶
请参阅步骤 16。
核酸和寡核苷酸
DNA 分子质量标准，原始的重组 M13 噬菌体单链 DNA
培养基
2xYT 培养基
含 0.25ug/ml 尿嘧啶的 2XYT 培养基
离心机和转子
SorvallGSA 转子或相当的产品
SorvallSS-34 转子或相当的产品
专用设备
Corex 离心机管（15 ml 和 30 ml)
巴斯德滴管
柱层析树脂
使用预先包装的树脂例如 SephacrylS-400(Pharmacia) 或微量制备离心柱（Promega)。
60°C 水浴
其他试剂
本方案步骤 1 需要的试剂已在第 3 章方案 3、4 和 6 中列出。
本方案步骤 6 需要的试剂已在第 3 章方案 1 中列出。
载体和菌株
请参阅附录 3。
大肠杆菌菌株 CJ236（dut-ung-F')
详细资料请参阅 Kunkel(1985) 和 Kunkel(1987)。
大肠杆菌菌株 TG1，JM109 或相当的菌株
请参阅步骤 6。
方法
1. 诱变准备
a. 将携带靶序列的小片段 DNA(<500bp) 克隆到适当的 M13 噬菌体载体，例如 M13 mp l8 或 mp l9。
b. 从一个由重组噬菌体产生的新生长的噬菌斑中分离单链模板 DNA 和双链复制型 DNA。
利用 M13 噬菌体载体进行克隆的方法以及制备单链和复制型噬菌体 DNA 的方法请参阅第 3 章方案 3、4 和 6。
c. 限制性内切核酸酶分析复制型 DNA, 单链 DNA 序列分析方法鉴定重组克隆的正确性。
Kunkel 过程也可用于从噬菌粒载体产生掺入尿嘧啶的单链 DNA(McClary et al.1989 , Wang et al.1989.Liuetal.1990, 综述文章见 Hagemeier l996)。本文中首先用含有靶序列的双链噬菌粒 DNA 转化 E.coli CJ236(或其他表型为 dut-ung-F'的菌株）至氨苄青霉素抗性。辅助噬菌体重复感染含靶序列噬菌粒 DNA 的细菌，使噬菌粒 DNA 的复制形式由双链 DNA 转变成单链 DNAs(请参阅第 3 章方案 8）。随着在尿苷培养基中生长，部分胸腺嘧啶位置上掺入尿嘧啶的单链 DNA 被包装进病毒颗粒并分泌进培养液。分离该 DNA (按步骤 5 所描述的）用作定点诱变的模板（方案 2)。使用噬菌粒载体不需要定点诱变前将起始靶 DNA 克隆进 M13 噬菌体载体。
2. 用灭菌的巴斯德滴管将一个单独的由重组 M13 噬菌体产生的噬菌斑转移到含 1 ml 2XYT 培养液的微量离心管中。
3.60°C 孵育 5 min 灭活细菌细胞（杀死细菌细胞防止在下一轮噬菌体繁殖过程中继续产生含胸腺嘧啶的病毒 DNA 是非常重要的)。剧烈振荡离心管 30s, 释放出包裹在顶层琼脂中的噬菌体。4°C 超速离心 2 min, 以去除死菌体和细胞碎片。
4. 将 50ul 上清液转移至一个含 50 ml 2xYT 培养液（补充 0.25ug/ml 尿嘧啶）的 500 ml 锥形瓶中。不需要像 Kunkel(1985) 最初描述的那样补加带胸腺嘧啶和腺苷的培养液。加人 5 ml 处于对数中期的 E.coli CJ236(dut- ung- F') 培养物。在 37°C 温度下伴随剧烈振荡 (300r/min) 培养 6 h。高效率的通气培养对噬菌体生长是极为重要的。
用于接种的噬菌体悬液一般为 109 和 1010pfu/ml。处干对数中期的大肠杆菌培养物含大约 5X108 个细菌/ml。病毒感染的低重复性（0.02~0.2pfu/ml) 保证了绝大多数噬菌体是从dut- ung- F'的大肠杆菌菌株中产生的。
5. 在 4°C 温度下，5000 g(6470r/min，在 Sorvall SS-34 转子）离心 30 min 收集细胞。将上清液转移到一个新的适合于 Sorvall GSA 转子或相当产品的 250 ml 离心瓶中。
6. 测定噬菌体悬液在大肠杆菌菌株 CJ236(dut- ung- F'),JM109 或 TG1 上的相对滴度（请见第 3 章方案 1)。噬菌体在菌株 CJ236 中的滴度应比在 dut+ung+菌株中髙出 4 到 5 个数量级。
为了节省时间，大多数研究人员在获得滴度测定结果之前就开始纯化噬菌体顆粒。然而如果延迟纯化，应将噬菌体悬液粗制品置于冰上保存。
噬菌体的产量随重组体的不同而改变。一般在dut- ung- F'的大肠杆菌菌株（CJ236) 上产生的病毒颗粒上淸液滴度为 5X1010 至 1x1011pfu/ml。然而，生长能力差的重组体可能达到的滴度仅为 1X1010 至 2X1010pfu/ml。如果单链 DNA 的产量不足，可经以下两种途径补救。
•测定用于感染在 dut-ung—F'大肠杆菌菌株的噬菌体贮存液的滴度。将接种物的体积调节至 0.1pfu/细苗细胞使其有利于重复感染。感染培养物培养 6 h。
•感染培养物生长 12 h 而不是 6 h。如第 5 章屮所述，在延长培养过程中各种缺失体可能比野生型重组体生长速度快，因此最好确证用做模板的单链 DNA 大多数分子大小正确。用凝胶电泳分析 M13 噬菌体 DNA 的方法可参阅第 3 章方案 1。
7. 测量噬菌体悬液的体积，然后加入 0.25 倍体积的含 15%(m/V)PAGE 8000 的 2.5mol/L 的氯化钠，摇晃离心瓶以混匀反应物，将离心瓶置冰上 1h。
8.4°C，5000 g（5500r/min,Sorvall GSA 转子）离心 20 min 回收沉淀的噬菌体颗粒。以抽真空吸入方式吸去上清液，倒置离心瓶使残留的上清液完全流出。再用一个连接真空抽气装置的滴管吸去滞留在离心管壁上的所有液体。
9. 将噬菌体沉淀物悬浮在 4 mlTE 缓冲液中（pH7.6)。将悬浮液转移到一个 15 ml 的 Corex 离心管中。再加入 2 ml TE 缓冲液（PH7.6) 清洗离心管壁将洗液合并至 Corex 离心管中。剧烈振荡悬液 30s, 将离心管置于冰上 1h。
10. 剧烈振荡噬菌体悬液 30s, 然后 4°C,5000 g(6470r/min,Sorvall SS-34 转子）离心 20 min 将细菌碎片收集至离心管底部。
11. 小心将获得的上清液转移到一个 15 ml 的聚丙烯离心管中，转移上清液时应不要带入细菌碎片沉淀物。用苯酚（pH8.0) 抽提悬液 2 次，苯酚：氯仿抽提 1 次。室温4000 g(5800r/min 用 Sorvall SS-34 转子）离心 5 min 使各相分离。避免转移界面物质。
12. 将从最后一次抽提中获得的水相转移到玻璃离心管内（例如 30 ml 的 Corex 离心管）。测量溶液的体积，加入 0.1 倍体积的氯化钠（pH5.2), 苒加入 2 倍体积 0°C 预冷的无水乙醇。彻底混匀内容物，将离心管置于冰上 30 min。
13.4°C,5000 g(6470r/min,Sorvall SS-34 转子）离心 20 min 回收 DNA。小心去除离心后的上清液。加入 10 ml 室温保存的 70% 乙醇。稍微旋涡后再离心。
14. 小心吸去上清液，室温倒置离心管直至乙醇彻底蒸发。将 DNA 溶解在 200ul TE(pH7.6) 缓冲液中。
15. 按附录 8 描述的方法，用能够排除大分子 DNA(大于 100 个核苷酸）的离心层析柱纯化悬液中含尿嘧啶的单链 M13 噬菌体 DNA。
通过离心柱层析纯化在dut- ung- F'大肠杆菌菌株中繁殖的单链 M13 噬菌体 DNA 以去除其中污染的小分子量的 DNA 和 RNA 寡核苷酸。这些非特异性的寡核苷酸可作为随后诱变反应中的引物，引起髙背景的假阳性噬菌斑。
16. 用分光光度计在 260nm 波长测量 DNA(1OD260=40ug/ml)(见附录 8 DNA 定量部分）。用最初的单链 M13 重组体 DNA 作为分子量标准，取 0.5ug 上述 DNA 样品进行凝胶电泳分析 DNA 分子量大小。
17. 按方案 2 所描述的方法进行寡核苷酸定向诱变分析。 |
|---|
