培养单神经元的光学记录技术实验2

2019.4.12

五、信号处理方法
即使选用最好的指示剂和最佳的仪器，有些光学信号仍然很弱，伴有或只有噪声。
另一方面，所用探测器的灵敏度可能很差，或所测生理指标性质上为量子性信号。无论怎样，都要格外注意从背景噪声中提取出所需要的信号。噪声可能包括：系统噪声和随机噪声。
在某些情况下，系统噪声能被检测出来，进而能用减法或除法取消其影响。相反，随机噪声就很难与有效信号相分离。信号平均是消除真正随机噪声影响的方法之一，不过，信号乎爲有时并不可行（如非固定事件)。在单一扫描记录中，只有那些与信号在频谱上可分离的随机噪声成分能被清除（如通过滤波)。
为了克服光学记录实验中的噪声问题，可以使用许多信号处理和降低噪声技术，它们包括：源噪声比值法、数字滤波法、信号平均法。
1.源嗓声比值法
存在于实验记录中的系统噪声可分为两类：相加的或相乘的。通常，相力帷噪声可用减法去除，而相乘性噪声能通过比值法进行最好的校准。由信号源强度变异所产生的相乘性噪声，是光学记录实验中最常见的噪声源，尤其在荧光相对变化等于或小于光源产生的波动时特别明显。在这种情况下，很难从噪声中分离出有效信号，这对于激光光源来说是个很普遍的问题，因为这种光源强度的变异能达到 5% 峰-峰值。然而，这些变异可以测量，并用比值法从信号中消除掉。实际上，对信号测量值和参考测量值进行比值计算，是去除源噪声最有效的方法。此法比减法更优越之处，在于不需要在信号与参考之间进行振幅匹配，Bullen 等（1997) 对此法的有效性进行了描述，图 4-5 通过一个实例来说明。
另一种消除源噪声变异的方法，是计算两个发射光波长之间比值，此时，源噪声的变异作为共同模式信号存在于两种波长中，也就可通过比值计算处理而被有效消除。
2.数字滤波法
数字滤波是一种重要的信号处理工具，常用于降低随机噪声或有害信号在记录信号中的影响（请参考第四十五章)，这对于不固定的信号和不能平均的信号来说是非常有用的。数字滤波法的原则，是将有用的频率根据其是信号还是噪声而被分离出来。以下是四种主要的数字滤波类型：低通法、高通法、带通法、带阻法。
在控制实验记录带宽以保留有用的信号成分而去除高频成分方面，低通滤波器是很重要的。高通滤波也称为 A/C 耦联，有利于去除信号中的直流成分，只显现变化的部分。带阻（或切迹）滤波器阻止某一特定带宽，在去除实验记录中的交流噪声特别有用。
另有特殊的滤波器，既可保留高频成分又发挥低通滤波器功能，其中一个例子是 Savitzky-Golay 滤波器法，基本上是在局部区域进行多项回归，进而为每一数值点确定一个平滑化的值。这种方法之所以优于其他滤波方法，在于它能保留数据特征如峰高和波宽，而这些特征通常会被相邻数据平均法和低通滤波「洗掉’
通常在科研制图软件包中有这些数字滤波器的各种应用（如 Origin 或 SigmaPlot), 在特殊的数学软件中也可找到（如 Matlab 或 Mathematica)。
注意：务必避免滤过频率中含有重要的信号成分，而且，必须承认有些滤过方法会导致数据出现小的相位偏移，不过现在的限定脉冲反应（FIR) 数字滤波器能反向应用以解决这一问题。最后，应当注意不要违反采样的原则（参见第四十五章「数据的采集和数字化」)。
注意：在所有数据获取或处理的各个阶段（从探测器开始）都应用模拟滤波器（主动的或被动的)，无疑是明智之举，这能明显降低有害噪声在每一阶段的聚集，并减少随后数字滤波的需要程度。
3.信号平均法
信号平均法是指按区域或重复测试的时间或空间上进行归类，以降低随机噪声的影响（参见第四十五章)。如果噪声真是随机的，那么信号平均法能按因素 Jvl 降低噪声，N 是测试重复的次数。这种平均法要求事件固定并包括所有出现的频率成分，即用于平均的信号是严格的时间-锁定事件。如果采用信号平均法，应注意不要导入任何时间性颤抖（如生物性或仪器性的)，否则会引起低通滤波效应。在有这样问题的情况下，像动作电位这样的事件可以按其峰值分类，并进行平均化以提高整个信号的质量。
信号平均法的效果例示于图 4-6。在这个例子中，给出的是检测 VSD 比值法数据线性问题的实验，随着实验次数增加，平均信号法使相对噪声成正比降低。
实时平均法的一个缺点，在于总体测试频率通常会降低，因为要花时间采集足够的记录次数用于平均。这限制了在一定时间窗内能够采集的数据点数，进而在那些对药物或实验操作的反应时程很重要的实验，可能是一个问题。
六、结果
这一部分将介绍实验结果的表达和展示方面的重要原则。它们包括.
—数据表达
—实验记录的重要特性
一实验的类型及典型的记录
1.数据表达
从单神经元或部分神经元获得的光学记录结果，可以多种方式进行表达，具体包括以下几个方面。
—-维记录：从单一位点记录的信号，或从图像的单独点或单独区域（ROI) 提取的数据，显示为一维的对时间作图的记录线
_伪色成像：以区别活动水平或离子浓度变化的一系列彩色图像一实况录像：直接来自实验中获取图像的、有时可调速的再现资料尽管录像和伪色成像提供一个优质的、定性显示的数据，但这种方法常常难以显示时间过程和 (或) 定量的变化 r 而且，还难以将这些图像与其他同时测量的一维参数（如电流、电压）进行综合分析。
2.实验记录的重要特性
现在的文章中有一个令人遗憾的倾向，就是提供过度简化的数据，而且在许多情况下原始数据被完全省略了。这种情况确实存在于光学记录研究中，即许多记录常常被简化成单一的伪色图像。然而，为了他人能对有效数据质量进行判断，提供一些原始记录仍然是重要的。在检查这一类数据时，对如下各种问题进行考虑是重要的，如提供的记录是否有以下显示：.
一检测的灵敏度：对于所做的测量来说，记录方法和使用的指示剂是否足够灵敏
—信/噪比：给出的信/噪比是否足以获得有用的实验结论？是否还能进一步优化
一时空分辨率：选用的方法是否有足够的时空分辨率回答实验所提出的问题
一保真度：所提供的记录是否为有效生理学事件的精确反映？有无记录方法本身造成的干扰和变异存在
3.实验类型及其代表性记录
本章提供了许多实验记录，用以说明在单神经元实验中可能见到的各种实验记录类型。例如，前面提供的比值信号取自检查 VSDdi-8-ANEPPS 线性关系的试验。这一记录是在紧贴膜片钳电极旁的扫描位点获得的，证明了在光学信号和电压钳指令波形之间，存在着反应时间和幅度上很好的一致性。此类校准随后能量化在更接 ia 生理条件下完成的类似光检测数据。

在用同样 VSD 的一个不同例子中，检测了培养的海马神经元突触后电位在树突的整合在海马和传导模式（图 4-7)。这个实进验能从多方面进一步说明这种光学记录法的用途。特别是这些记录系用非侵入方法从很小细胞获得的。而且，在不同记录位点（直径 2ym) 几个检测可同时进行，这对其他方法来说并非易事。再者，这些信号的获取频率（如 2kHz) 足以充分地对欲测生理学事件进行采样。
在一个类似的实验中，检测了在一连串动作电位之后，同一细胞邻近位点所产生钙信号的空间差异性（图 4-8)。此例证明了在同一细胞不同位点之间，以高时间分辨率检测到钙瞬流的幅度和动力学上的空间差异性。

注意事项
这部分介绍一些在光学记录实验中常见的问题，主要对以下几个方面加以描述:
一信号质量问题
一光动力学损伤的预防
一负载和染色问题
一、信号质量问题
所有记录技术中最重要的因素就是所能达到的的信/噪比（S/N)。这对一些光学指示剂（尤其是 VSD) 来说尤为重要，因为它们的相对荧光变化非常小。许多因素能影响信号质量，包括以下几个方面。
激发光强度：由光学指示剂产生的荧光直接与激发光强度成正比，因此应该选用可能的最强光源，不过要注意避免过强光照导致指示剂的漂白和光毒性。
指示剂浓度：发射光强度亦与指示剂浓度成正比，故应尽可能选用最大量探针。不过又要注意避免染料的浓度有药理作用或缓冲作用，这可改变欲测生理学参数（详见「负载与染色问题」)，而且在很高的指示剂浓度下，发射光强度由于「猝灭现象」而开始衰减。
激发容量：在扫描显微镜中，来自大的激发容量（如较大的扫描点）的信号要强于小的激发容量，因为更多的荧光物被激发。因此在小的扫描点空间分辨率高，但激发容量及信号强度降低，这是需要平衡的问题。
指示剂敏感性：最佳信号质量来自于高敏感性的光学指示剂，因此在选择指示剂时，应选用敏感性高的指示剂。
指示剂亮度：在选择指示剂时，总应选择亮度最高的一种。比较绝对指示剂亮度的指导原则将列于后一部分 (「比较指示剂的标准」)。
最大聚光效能（N.A. 和滤光片）：应该重点牢记的是，聚光效能取决于以下几个因素，包括数值孔径（N.A.)、物镜的绝对传递能力、显微镜的相对容许能力和分色镜与相关滤光片的传光能力。一般来说 10% 的总聚光效能是很常见的，如果在不好的情况下这个值还会更低。所以，若选择物镜的话，应选择最高 N.A. 值的物镜。这样的选择会使光照强度最大化而发射光的聚集最优化。相似地，也应该注意选择分色镜和发射光滤光片，以免它们排斥大部分的信号。其他光丢失的可能原因还有：使用 DIC 镜片而没有从发射光路中去掉分析器，不洁的镜片或光路错位。仅 DIC 分析器本身就可使发射光强度再减少 50%。
最大的检测效能（Q.E.): 在各种情况下，尤其在光亮水平较低时，应优先选用一个可能量子效能最高的探测器，这可保证所获得的光子能全部转化成有用的信号（表 4-5) 〇
记录带宽：记录带宽只需足以获取有效信号即可。超过记录所需的时间带宽，只会增加噪声。但是，如果存在额外的时间带宽，可被用于通过数字化附加采样来提高信号质量。附加采样是指平滑处理时间的方式，即对先前几个空间上相近的采样点进行平均。这一方法可用于降低随机噪声，按 N^-1/2 成正比地提高信噪比，N 是附加采样的次数。
二、光动力学损伤的预防
过度的光照强度有时会造成光损伤或光毒性。在许多情况下，这种现象源于自由基的产生，如荧光激发时的副产品单态氧。这些自由基可以干扰膜的完整性。尤其在应用在质膜的 VSD 时，对膜的干扰是一个特别普遍的问题。减少荧光指示剂所致的光损伤有^种 T 同的方法，有些是在孵育液中加入大量抗氧化剂以使光损伤最小化，有些是在特定部位加少量抗氧化剂（如在细胞膜上)，还有一些方法是将氧自由基从溶液中彻底清除。如下是一些例子：
1.ACE 等：最简单的降低溶液中自由基作用的方法，就是在孵育液中加入大量的抗氧化剂，建议使用的抗氧化剂包括各种维生素（A,C 和 E;ACE) 和其他类似制剂 (如 Trolox;Fluka)。然而，使用这些物质的方法还没有很成功的报道，可能是因为在损伤位点（如膜）不能提供直接的保护所致。这类制剂及其溶解和储存的资料一并列于表 4-7。
2.虾青素：一种更直接的方法是用自然的类胡萝卜素—虾青素。这种物质最初用作抗氧化剂，是与一种新的基于荧光共振能量转换原理的 VSD 合用（GonzalezandTsien1997)。从理论上说，这一方法的有效性比在溶液中使用的抗氧化剂强，因为它既能与膜密切结合，又有很强的去除活性氧能力。同时，即使使用浓度很高，也不必担心它的毒性作用。和其他的胡萝卜素如卩-胡萝卜素相比，虾青素及其相对高的水溶性, 无疑是一? 种值得特别推崇的抗氧化剂。然而，初步报道表明虾青素与其他类型 VSD 合用效果甚微。有关虾青素的可溶性、储存以及使用的相关信息请参阅 Cooney 等 (1993)。
3.葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶：葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶结合无疑有很强的除氧能九用于 VSDdi-8-ANEPPS 尤为有效（Obaid and Salzberg 1997)。葡萄糖氧化酶从溶液中摄氧生成过氧化氢，随后过氧化氢酶将其转化成水。这些酶的高催化活性，意味着相对少量的酶（葡萄糖氧化酶 40U/ml 和过氧化氢酶 800U/ml), 即足以在溶液中发挥去氧化作用。葡萄糖氧化酶（G-6125) 和过氧化氢酶（040) 均由 Sigma 提供（St.Louis,M0)。
4.Oxyrase:Oxyrase 是一个生物催化氧降解系统。它的商品制剂也用于细胞孵育液中除去活性氧。Oxyrase 系从大肠杆菌制备而来，作为天然制剂使用时，需要将乳酸、甲酸、號祐酸加入孵育液中作为氢供体。初步研究显示其与荧光染料指示剂合用，在许多情况下都是一种有效的抗氧化剂。Oxyrase 可从 Oxyrase 公司（Mansfield,0 H) 获得。
抗氧化剂的比较
光损伤的问题并没有得到全面的解决，在许多情况下如何用好抗氧化剂仍然凭经验行事。然而，上述提到的一些方法明显比其他制剂有效。从我们使用 VSD 的经验来看，葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的合用是单细胞短期实验中效果最佳的方法。
三、负载和染色问题
VSD
关于 VSD 染色常有三类问题，它们是：
1.染色不足/膜亲和力低：一些 VSD(如 RH414) 与某些种细胞有相对较弱的膜亲和九而其他的 VSD(如 di-8-ANEPPS) 对细胞的染色又特别慢。这些染料的结合亲和力部分与它们自身结构有关，但膜的构成也是个重要因素，而且还有显著的种属和细胞类型差异性（Ross and Reichardt 1979)。有三种方法可能解决这类问题。首先，，开始新的系列实验之前，应对比较合适的染料进行筛选，找出与膜亲和力最高、产土怡号强度最咼的染色剂。其次，应该在大范围的染色时间和条件上加以认真考虑，以确定最佳的染色条件。最后，在染料储存液中加入一些试剂（如 0.05% PluronicF—127) 将有助于染料进入细胞膜。
2.过度染色：用过量的 VSD 会导致各种毒性作用。特别明显的是，由游离染料或非特异性定位结合的染料所产生的非特异性荧光，可严重降低信号的强度和质量。更有甚者，用高浓度的 VSD 可能会有药理学作用，因此推荐使用能产生最佳信号的低染料浓度。
3.染料内化：因为 VSD 滞留于细胞膜外层，这样某些染料分子就有可能会跨膜进入内层，甚至直接进入细胞内并定位于细胞器质膜上。各种膜的循环过程也能帮助转运 VSD 进入细胞内。这种染料内化的结果是降低了信号的强度，因为这些染料分子可能对膜电位缺乏敏感性，或具有与正常定位染料直接反向的敏感性。解决此问题的办法就是使用不易内化的染料（如 di-8-ANEPPS)。此外，高于室温的孵育温度也会增加染料内化进入细胞的可能性，故要尽量避免，
CaSD
用 CaSD 负载细胞通常有四类问题，其中两类与 AM 酯负载技术有关。它们是：
1.间隔作用：在理想状态下，用这一技术负载的突光指示剂，应均匀地分布于胞浆中，而不存在于其他细胞区域。然而 AM 酯能聚集在细胞内任何一个膜封闭的区域内。此外带有多价阴离子的指示剂，也能通过主动转运而潴留在各细胞器内。这种异常的隔离作用，通常是由于升高负载温度造成的，故通过降低负载温度可以避免。使用与葡聚糖结合的指示剂也能降低分隔和潴留效应。
2.不完全的酯水解：低的或慢的去酯化率，能导致细胞内部分去酯染料比率的显著增加，它们对钙离子不敏感，但仍然有些荧光。这会导致明显低估细胞浆内真正钙离子浓度。此外，不完全酯水解也能促进间隔作用。用只能与去酯形式染料结合的 Mn2+进行荧光猝灭，是对这一作用进行定量分析的方法。避免 AM 酯异常荧光效应的方法之一，就是选择那些酯化物不发荧光的指示剂。例如，钙绿和俄勒冈绿 488BAPTA 基本上是非荧光的 AM 酯，而 Fura-2 和钙橙黄的 AM 酯仍然有一定的基础荧光。
另外两个在 AM 酯负载和 CaSD 游离盐溶液的微量注射或透析均可出现的问题是：
1.过度染色：不管是用 AM 酯或盐溶液负载单神经元，必须要注意避免过度负载细胞，否则会造成有害的缓冲效应。这种缓冲可影响静息钙离子浓度、钙瞬流的大小和动力学，并干扰依赖转离子的各种细胞话动。简言之，使用不正确的指示剂浓度，将会导致信号质量差，直至失真的生理学结果。证明所记录的信号没有受到任何缓冲作用影响的一个方法，就是在全部指示剂浓度范围进行实验。
2.漏出：许多阴离子指示剂在某些细胞中易于漏出或主动渗出。在一些情况下，可用药理学工具药（如丙黄舒、苯磺唑酮和维拉帕米）将其阻断。另一个方法就是设计一种有抵抗力的指示剂，特别是与葡聚糖结合的染料通常都能抵抗渗出和漏出。如今，得克萨斯突光实验室（TexasFluorescenceLabs,Austin,TX) 已经研制了一系列这样的漏出抵抗型钙离子染料（如 FuraPE3,IndoPE3,FluoLR)