结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用
结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升，据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌，即20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核病人约2 000万，每年新增结核病人约800～1 000万，每年约有300万人死于结核病［1～3］。结核病已成为导致全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高发国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。据2000年全国结核病流行病学抽样调查估计，全国现有活动性肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人150万［4］。结核病防治是我国乃至全球疾病防治的重要课题。目前，出入境人员体检诊断传染性肺结核的主要方法是通过胸部X片检查，加上痰涂片抗酸染色镜检和PPD试验联合检测。由于胸部X片是根据临床症状进行诊断，缺乏病原学依据，加上肺结核与其他肺部疾病在胸片上有相似的地方，容易出现误诊和漏诊；痰涂片抗酸染色的阳性率低，采样不合格标本的阳性率更低，极易出现漏诊；而PPD试验的特异性不强，不能作为确诊肺结核的依据。因此，这三种检测方法的组合模式在检测肺结核上存在着较大的缺陷，易导致传染性肺结核病人的漏诊，而少数肺部疾病或其他部位结核的病人可能出现误诊，降低了出入境人员传染性肺结核监测的效果。分子生物学方法以其简便、快速，特异性高的特点成为结核分枝杆菌检测研究的热点。国内外大量研究证明PCR检测结核分枝杆菌敏感性达到100％，本研究以荧光PCR技术为基础，开发适合传染性肺结核快速诊断模式，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
确诊肺结核病人培养涂阳的结核痰液标本102份。正常人的痰液25份，葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯球菌痰液标本共计20份。
1.2 引物与探针
根据对NCBI数据库结核杆菌基因序列分析，找出其保守序列，并且在此区域应用Primer5.0 和Primer express 3.0软件设计引物与探针，探针的5’端标以荧光发射基团FAM标记，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA标记 (表1) 。Forward Primer：5’TAGGCGTCGGTGACAAAGG3’；Reverse Primer：5’GGGTAGCAGACCTCACCTATGTG3’；Probe：5’CACGTAGGCGAACCCTGCCCA3’。
1.3 仪器
ABI公司的ABI7500荧光Real－time PCR仪。
1.4 痰液DNA提取
1.4.1 痰液样品的预处理
吸取待测痰液200μl放入1.5ml的eppendo管中，加入5mol/L NaOH 500μl，混匀，室温中摇动20min。加入1mol/L NaH2PO4 700μl，混匀(起中和作用)，10 000rmp离心5min。去上清液，补加TE至100μl，混匀，加入20μl浓度为50mg/ml的溶菌酶。置37℃消化30min。
1.4.2 DNA的提取
细胞复合裂解液置65℃水浴中，使其中的结晶溶解。将300μl结晶已溶解的细胞复合裂解液加入到上述预处理好的痰液样品中，混璇器震荡混匀20秒，置65℃水浴中反应20min。加入200μl蛋白沉淀液，上下颠倒5～6次使两者混匀。16 000rmp离心3min。将上清液(约500μl)转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，此时可见透明的絮状物，混匀后16 000rmp离心3min，倾去上清。加入200μl 70％的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，16 000rmp离心3min。吸去70％乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，乙醇挥发完全，加入30μl DNA溶解液，快速漩涡震荡1～2秒，使沉淀的DNA完全溶解。
1.5 标准品的制备
标准品包括：阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品。以结核杆菌阳性DNA样品2μl做为PCR反应的模板，加入PCR反应液23μl，PCR反应液中含有10x PCR Buffer 3μl、25mmol/L MgCl2 1.2μl、10mmol/L dNTPs 3μl、4U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl及10pmol/L上、下游引物各1μl，灭菌双蒸水13.3μl。于PT-200 PCR扩增仪进行如下循环：先94℃预变性4min；然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒回收PCR电泳产物，与线性化后的pMD18-T载体（Invitrogen公司）4℃下连接12～16h，连接反应体系中含有PCR凝胶回收产物3μl、连接缓冲液5μl、线性化后的pMD18-T载体1μl和T4连接酶1μl，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的1.5％琼脂固体LB培养基上，37℃倒置培养12～16h，用灭菌牙签挑取单克隆，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的5ml液体LB培养基中，200rpm摇床37℃震摇过夜；取1.6ml过夜培养物，抽提质粒，经PCR初步鉴定，对阳性克隆进行测序分析，将筛选出的阳性菌株进一步扩增，抽提质粒DNA，用核酸蛋白紫外分析仪准确定量(连续测定4次，每次重复4管，取均值)，并进行10倍系列稀释，得到浓度分别为108、107、106、105copies／ml的4个标准品，即为阳性定量参考品。阴性质控品以生理盐水制备，强阳性质控品和临界阳性质控品根据浓度和拷贝数以标准品经灭菌水稀释后制得。
1.6 Taq-man探针实时PCR及反应条件
反应液总体系为20μl，每份反应液中含有2×Probe－PCR Master Mix 10μl，上、下游引物(10μmol/μl)各0.5μl，探针(10μmol/μl)0.2μl，灭菌水6.8μl，结核杆菌阳性DNA样品2μl。反应条件为: 95℃ 15min(×1) ，94℃ 10s→60℃ 20s →72℃ 30s(×40)。按照上述反应体系及反应条件，随着PCR体系在每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。
1.7 琼脂糖凝胶电泳，测序
实时PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V，时间1h。ABI3130基因分析仪序列分析。
1.8 特异性实验
分别用阴性痰标本提取物25份和金黄色葡萄球菌DNA提取物、肺炎链球菌DNA提取物、肺炎克雷伯杆菌DNA提取物共20份为对照模板进行Taq-man探针进行实时PCR检测。
1.9 检测限实验
对阳性样本以10倍梯度进行稀释，共5个稀释度，最大稀释倍数为10万倍，然后以各稀释液为模板进行实时PCR检测。
1.10 重复性实验
对107标准品重复测定4组10倍倍比稀释阳性DNA 五次,分别统计其Ct 值。
1.11 灵敏度实验
对102例痰液标本分别进行抗酸染色显微镜检测和实时PCR检测。
2 结果
2.1 定量曲线
各个稀释度标准阳性株在第一个循环结束后测到一个基础吸光值，接下来一直到第20个循环结束时都没有明显变化。从第23个循环开始其中的一个反应的吸光值增大，定量曲线开始抬头，25个循环(Ct 值) 后，曲线迅速上扬，至第36个循环前后达到峰值，随后进入平台期，一直到反应结束。阴性对照未出现扩增曲线（图1）。
2.2 琼脂糖凝胶电泳结果
痰液DNA进行验证实验，对所获取的PCR产物进行测序，序列分析显示该产物为TB核酸序列。
2.3 特异性实验
葡萄球菌等呼吸道易感菌的DNA提取物为对照模板进行Taq-man探针进行实时PCR未检测到无荧光信号。
2.4 检测限实验
对阳性样本以10倍梯度进行稀释，然后以各稀释液为模板进行Taq-man探针进行实时PCR检测，荧光信号随样本浓度下降而下降，线性范围为103～107copies/ml，检测下限为102copies/ml。
2.5 重复性实验
重复测定4组10倍倍比稀释后的标准品，浓度由高到低的Ct 平均值分别是21.07、24.6、28.16、31.57，标准差分别是0.69、0.88、0.39、1.82，变异系数分别是3.9%、4.3% 、1.6%、6.9%，随着标准品拷贝数的降低，Ct 值增大，标准差和变异系数也呈逐渐增大的趋势。
2.6 灵敏度实验
对确诊肺结核病人102例痰液标本分别进行直接涂片染色法和实时PCR检测结果对比。直接涂片染色法检测灵敏度为30％。荧光PCR检测灵敏度为100％。
3 讨论
肺结核的实验室快速诊断对出入境人员传染性肺结核的发现有重要的意义，目前，肺结核的实验室诊断方法主要有细菌学检查、免疫学检查和分子生物学检查。
细菌学检查是目前传染性肺结核诊断的金标准，检测出来的阳性对肺结核的诊断的意义最大，主要有痰涂片抗酸染色直接找分枝杆菌和分枝杆菌培养方法。但是，痰涂片抗酸染直接镜检法的阳性率不高，阳性率只有14%～47%，且受痰标本质量的影响，阳性率相差很大［1］。提高痰标本的质量，加强痰涂片镜检的质量控制是目前国内外研究的重点［4］。培养方法的阳性率稍高于涂片法，且能得到活菌，但由于结核分枝杆菌的生长速度太慢，检测的时间长，传统方法培养需要5～8周时间。BACTEC是采用放射性同位素技术对结核菌进行自动检测的仪器，使培养分枝杆菌可以把培养时间大大缩短，需9～14d。分枝杆菌生长指示管（MIGT）使用荧光计量技术检测分枝杆菌的生长，无污染，阳性率高［15,16］，时间短，是快速培养的主流。
实验室检测结核分枝杆菌是临床结核病诊断的主要依据。传统检测结核分枝杆菌的主要方法为直接涂片法和培养法［20］，但直接涂片法存在特异性差、灵敏度低和不能鉴别抗酸菌死活的缺点，而培养法则存在特异性差和需时较长的不足［5］，实际临床应用受限。本实验中102例标本实时PCR阳性102例(102%)，而直接涂片法只有30例(30%)。实时PCR法与抗酸染色法比较符合率为100%。实时PCR法操作简便、快速、高效，具有很高的敏感性、特异性，且其在密闭体系中完成扩增并进行实时测定，降低了污染可能性，并可精确地进行定量检测，为传染病监测提供参考。实时PCR技术特别对一些含菌量低的标本(如尿液、胸腹水)的检测具有非常实用的价值，大大提高了结核分枝杆菌的检出率。实时PCR检测原理为TaqMan探针法，是在反应体系中加入一个荧光标记探针，探针的5′端标以荧光发射基团FAM， 3′端标以荧光猝灭基团TAMRA。实时PCR过程中，利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性释放荧光信号。模板每复制一次，便释放一个荧光信号，根据荧光强弱可对模板进行准确定量。由于实时PCR采用闭管操作，克服了常规PCR的污染问题，使其具有很高的特异性。实时PCR技术尽管有少数假阳性的结果，但其与常规细菌学方法互补使用可提高阳性检出率，仍不失为灵敏度高、特异性强的结核病辅助诊断的有效方法之一。 本研究结果显示， 痰涂片抗酸染色镜检阳性率(30%)较低，是可能因为抗酸染色受痰中细菌数量限制，一般至少每毫升痰液含(5×103)～(1×104)个细菌方可得出阳性结果，且结核病人是间断性排菌，可能造成假阴性。这就要求我们在抗酸染色时要严格控制条件，挑取标本中干酪样或脓性部分，以提高阳性率。而实时PCR检测法阳性率明显高于抗酸染色法和改良罗氏培养法，且特异性为100%，这和荧光定量PCR的原理和它所采用的一系列新技术密切相关。尤其是结核病患者经药物治疗或体内出现了细胞壁缺损的L型细菌导致分离培养结果呈阴性时，此方法检测结果仍不受影响。在本实验中我们只用阴、阳性来表示结果，但实时PCR可以做到相对定量，且定量结果可以指导临床用药和疗效评估。实时PCR检测结核抗酸杆菌DNA每毫升痰中只需少量细菌即可获得阳性结果 ，并且在本实验建立过程中，无一例抗酸染色阳性和(或)培养阳性的标本实时PCR检测为阴性。实时PCR是临床上广泛应用的一种基因定量检测技术，使我们获得一个从分子水平确定结核的新方法，为结核的快速诊断提供了有力参考
