抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体检测的应用进展
类风湿关节炎(rheumataid arthritis，RA)是一种以慢性关节炎为特征的系统性自身免疫性疾病，该病如不及时诊断治疗，即可出现软骨和骨的侵蚀性病变，造成关节结构破坏，最终发展成为关节畸形、强直，导致不同程度的残疾，因此早期诊断至关重要。但是，目前的诊断均依据1987年美国风湿协会修订的RA分类诊断标准，其中临床实验室诊断最常用的是检查血清中的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)，由于RF受某些抗原、抗体物质的干扰，常出现假阳性，特异性不高，常常只能根据临床症状和x线表现诊断，从而导致误诊和漏诊，因此人们一直在寻找特异、敏感的实验室指标以助诊断。
2000年Schellekens等以合成的环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)作为底物用ELISA方法检测RA血清中的抗体，发现此抗体对RA具有很高的特异性和敏感性，可用于RA的诊断。抗CCP抗体的检测为RA的早期诊断提供了较好的血清学指标，目前国内正在逐渐开展临床应用。
◆抗环瓜氨酸肽抗体的生物学特性
抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，由类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)患者B淋巴细胞分泌的特异性较高的抗体，其他疾病和正常人群的B淋巴细胞不分泌抗CCP抗体。
瓜氨酸相关自身免疫系统指RA患者血清中的一些抗体在化学结构上具有相关性，即表位均含有瓜氨酸，该系统在RA的早期诊断中发挥关键作用，抗CCP抗体就是其中重要的一种。瓜氨酸是人体中的稀有氨基酸，由精氨酸在转录后经酶修饰生成，仅存在于人类的少数几种蛋白中，包括丝集蛋白、中间丝集蛋白。在细胞分化过程中，口腔黏膜上皮细胞角质颗粒中的丝集蛋白前体被酶分解成丝集蛋白亚单位，同时，蛋白去磷酸化，精氨酸在多肽精氨酸脱亚氨酶(peptidyl arginine deiminase，PAD)的催化下脱氨基而转化成瓜氨酸残基，瓜氨酸残基是抗原决定簇的必要成分，能被RA血清特异性识别。但是，由于它以人的口腔黏膜上皮细胞为反应底物，不易选择合适的人群。
1998年Schellkens等和1999年Girbal-Neuhauser等根据基因库中各序列号丝集蛋白的氨基酸序列进行分析，合成了一条以瓜氨酸代替精氨酸的约20个氨基酸残基的肽链，并证实瓜氨酸是RA患者血清中抗丝集蛋白相关抗体识别的主要抗原决定簇成分。应用合成的瓜氨酸肽作为基质，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)可自RA早期患者的血清中检出抗瓜氨酸肽抗体，甚至在临床症状出现前就可检测到。但是，由于瓜氨酸肽的肽链较短，在溶液中的构象欠稳定，影响抗体对肽的亲和力。因此，应用β转角构象的肽链易与抗体结合的原理，形成了以环化肽模仿最初抗原决定簇β-转角构象的研究理念，以提高其对抗体的亲和力。2000年，Schelleken等以半胱氨酸替换由19个氨基酸残基组成瓜氨酸肽链中的2个丝氨酸，形成与β-转角构象具有相似结构的二硫键，合成CCP。采用CCP为抗原基质，采用ELISA法检测RA患者血清中的抗CCP抗体，为RA的早期免疫学诊断建立了有效方法。
◆抗环瓜氨酸肽抗体检测的临床价值
RA是致畸率高、后果严重、常见的自身免疫病，全世界约1％的人群患本病，发病2年内即可出现不可逆的骨关节损伤，并可引起心血管、神经等多系统损害，给患者带来极大痛苦，也给社会造成沉重的负担，早期诊断及治疗是控制病情的关键。现行的实验室诊断主要靠检测RF，但3％～5％的正常人群可以检测到RF，在结缔组织病、感染、肿瘤等疾病中RF也可为阳性，而近年问世的抗CCP抗体的检测给RA的早期诊断带来了希望。
目前，国外的抗CCP抗体对RA的检测已普遍用于临床，国内自2001年以来也逐步应用于临床。文献显示，抗CCP抗体的特异性多在94％以上，敏感性为41％～87％。可见抗CCP抗体检测对RA的诊断具有较高的特异度，与目前通用的RA分类标准中唯一的血清学诊断指标RF(敏感性高但特异性差)相比，具有明显的优势。而且对供血员的连续检测表明，抗CCP抗体的检出可以比临床症状的出现提前数年，可见这一新的血清学诊断指标对RA的早期诊断具有重要的意义，值得推广，以早期治疗患者，降低致残率。
多数研究资料表明，抗CCP抗体阳性反映病情活动，与关节发生侵蚀性病变具有密切关系，这也符合CCP抗原抗体复合物作为RA发病重要环节的病理生理理论。有学者对数百例RA患者进行1～6年的随访，通过影像学评分的连续观察指出，抗CCP抗体阳性患者较阴性患者更易发展成影像学可见的关节损害，也就是说，抗CCP抗体阳性患者发展为侵袭性疾病的可能性更大。研究还发现，抗CCP抗体与C反应蛋白及红细胞沉降率升高一样，在RA活动期也较非活动期显著升高，而RF在活动期与非活动期的差异不明显，说明抗CCP抗体比RF更能反映RA的病情变化，且变化趋势与C反应蛋白水平及红细胞沉降率一致，故可作为判断病情变化趋势及评价治疗效果的指标，对临床选择用药有一定的指导意义。
Jansen AL等通过不同类型的多关节疾病患者血清中抗CCP抗体的测定，预测了抗CCP抗体大于50AU/ml即可对早期类风湿性关节炎有较高的敏感性和特异性。Bizzaro N等检测了RA患者抗CCP抗体的水平，结果也同样显示了抗CCP抗体的临界值为50AU/ml。并且RA患者清血清中抗CCP抗体的平均水平为1100AU/ml（范围为：57～3419AU/ml）。而对照组抗CCP抗体的平均水平仅为6.8AU/ml（范围为：1～39AU/ml）。进一步证实了抗CCP抗体对RA患者的诊断价值。
抗CCP抗体检测在判断病情与预后中作用的不同结果，可能与病例选择、样本量、判断阳性标准及病变程度不同有关，其在判断预后中的价值有待进一步观察。敏感度结果差距较大的原因可能与试剂本身的因素、抗CCP抗体存在的异质性以及选择病例的病程长短和骨质破坏程度的不同有关。
◆抗环瓜氨酸肽抗体的检测方法
目前国内外市场上的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒主要应用酶联免疫吸附法（ELISA法），它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比，可定性或定量检测患者血清中抗CCP抗体。其特异性来自抗体或抗原的选择性，抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。ELISA法检测具有特异性高、价格低廉的优点，但是一般采用手工操作，操作繁琐效率低，且人为影响因素大，结果只能定性或不精确地定量。因此，在这高效率的自动化时代，特异性高、操作简便的全自动化检测方法必将有良好的市场前景。目前国内已有体外诊断试剂公司开发出采用 “胶乳增强免疫比浊法”检测的抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒，并已投入临床应用。
免疫比浊法（Immunoturbidimetric Assays）是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加，通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。而“胶乳增强免疫比浊法”是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在直径为15－60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而在免疫比浊法的基础上提高试验的敏感性。相对于“ELISA法”，“胶乳增强免疫比浊法”操作简单，抗干扰性更强，且可测线性范围也更宽，能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。
◆研究展望
几年来国内外的临床检验实践表明，抗CCP抗体是检测RA较好的血清学指标，具有高度的特异性和一定的预后价值，被公认是RA的一个有价值的诊断指标，对判断病程也有参考意义。因此，不少学者提出修正1987年美国风湿协会修订的RA分类诊断标准，增加抗CCP抗体作为第8个标准，以更好地早期诊断RA，这也反映出抗CCP抗体检测的广阔应用前景。今后抗CCP抗体诊断RA的研究目标是提高敏感度，甚至达到100％，解决途径是应用多细胞系的强化抗原决定簇，多个肽的诊断效率更高。
此外，多种检测指标联合应用也有利于RA的诊断。有研究者认为，抗CCP与RF联合检测可显著提高RA的诊断率，对早期诊断和尽早治疗、改善预后有较高价值。在检测中,二者联合检测的阳性率,较任何只作单项检测均有统计学意义(P<0.01)；另外，二者联合检测可以为临床提供更多的信息,如疾病的活动性、病情的严重程度、指导临床用药等。
类风湿关节炎(rheumataid arthritis，RA)是一种以慢性关节炎为特征的系统性自身免疫性疾病，该病如不及时诊断治疗，即可出现软骨和骨的侵蚀性病变，造成关节结构破坏，最终发展成为关节畸形、强直，导致不同程度的残疾，因此早期诊断至关重要。但是，目前的诊断均依据1987年美国风湿协会修订的RA分类诊断标准，其中临床实验室诊断最常用的是检查血清中的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)，由于RF受某些抗原、抗体物质的干扰，常出现假阳性，特异性不高，常常只能根据临床症状和x线表现诊断，从而导致误诊和漏诊，因此人们一直在寻找特异、敏感的实验室指标以助诊断。
2000年Schellekens等以合成的环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)作为底物用ELISA方法检测RA血清中的抗体，发现此抗体对RA具有很高的特异性和敏感性，可用于RA的诊断。抗CCP抗体的检测为RA的早期诊断提供了较好的血清学指标，目前国内正在逐渐开展临床应用。
◆抗环瓜氨酸肽抗体的生物学特性
抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，由类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)患者B淋巴细胞分泌的特异性较高的抗体，其他疾病和正常人群的B淋巴细胞不分泌抗CCP抗体。
瓜氨酸相关自身免疫系统指RA患者血清中的一些抗体在化学结构上具有相关性，即表位均含有瓜氨酸，该系统在RA的早期诊断中发挥关键作用，抗CCP抗体就是其中重要的一种。瓜氨酸是人体中的稀有氨基酸，由精氨酸在转录后经酶修饰生成，仅存在于人类的少数几种蛋白中，包括丝集蛋白、中间丝集蛋白。在细胞分化过程中，口腔黏膜上皮细胞角质颗粒中的丝集蛋白前体被酶分解成丝集蛋白亚单位，同时，蛋白去磷酸化，精氨酸在多肽精氨酸脱亚氨酶(peptidyl arginine deiminase，PAD)的催化下脱氨基而转化成瓜氨酸残基，瓜氨酸残基是抗原决定簇的必要成分，能被RA血清特异性识别。但是，由于它以人的口腔黏膜上皮细胞为反应底物，不易选择合适的人群。
1998年Schellkens等和1999年Girbal-Neuhauser等根据基因库中各序列号丝集蛋白的氨基酸序列进行分析，合成了一条以瓜氨酸代替精氨酸的约20个氨基酸残基的肽链，并证实瓜氨酸是RA患者血清中抗丝集蛋白相关抗体识别的主要抗原决定簇成分。应用合成的瓜氨酸肽作为基质，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)可自RA早期患者的血清中检出抗瓜氨酸肽抗体，甚至在临床症状出现前就可检测到。但是，由于瓜氨酸肽的肽链较短，在溶液中的构象欠稳定，影响抗体对肽的亲和力。因此，应用β转角构象的肽链易与抗体结合的原理，形成了以环化肽模仿最初抗原决定簇β-转角构象的研究理念，以提高其对抗体的亲和力。2000年，Schelleken等以半胱氨酸替换由19个氨基酸残基组成瓜氨酸肽链中的2个丝氨酸，形成与β-转角构象具有相似结构的二硫键，合成CCP。采用CCP为抗原基质，采用ELISA法检测RA患者血清中的抗CCP抗体，为RA的早期免疫学诊断建立了有效方法。
◆抗环瓜氨酸肽抗体检测的临床价值
RA是致畸率高、后果严重、常见的自身免疫病，全世界约1％的人群患本病，发病2年内即可出现不可逆的骨关节损伤，并可引起心血管、神经等多系统损害，给患者带来极大痛苦，也给社会造成沉重的负担，早期诊断及治疗是控制病情的关键。现行的实验室诊断主要靠检测RF，但3％～5％的正常人群可以检测到RF，在结缔组织病、感染、肿瘤等疾病中RF也可为阳性，而近年问世的抗CCP抗体的检测给RA的早期诊断带来了希望。
目前，国外的抗CCP抗体对RA的检测已普遍用于临床，国内自2001年以来也逐步应用于临床。文献显示，抗CCP抗体的特异性多在94％以上，敏感性为41％～87％。可见抗CCP抗体检测对RA的诊断具有较高的特异度，与目前通用的RA分类标准中唯一的血清学诊断指标RF(敏感性高但特异性差)相比，具有明显的优势。而且对供血员的连续检测表明，抗CCP抗体的检出可以比临床症状的出现提前数年，可见这一新的血清学诊断指标对RA的早期诊断具有重要的意义，值得推广，以早期治疗患者，降低致残率。
多数研究资料表明，抗CCP抗体阳性反映病情活动，与关节发生侵蚀性病变具有密切关系，这也符合CCP抗原抗体复合物作为RA发病重要环节的病理生理理论。有学者对数百例RA患者进行1～6年的随访，通过影像学评分的连续观察指出，抗CCP抗体阳性患者较阴性患者更易发展成影像学可见的关节损害，也就是说，抗CCP抗体阳性患者发展为侵袭性疾病的可能性更大。研究还发现，抗CCP抗体与C反应蛋白及红细胞沉降率升高一样，在RA活动期也较非活动期显著升高，而RF在活动期与非活动期的差异不明显，说明抗CCP抗体比RF更能反映RA的病情变化，且变化趋势与C反应蛋白水平及红细胞沉降率一致，故可作为判断病情变化趋势及评价治疗效果的指标，对临床选择用药有一定的指导意义。
Jansen AL等通过不同类型的多关节疾病患者血清中抗CCP抗体的测定，预测了抗CCP抗体大于50AU/ml即可对早期类风湿性关节炎有较高的敏感性和特异性。Bizzaro N等检测了RA患者抗CCP抗体的水平，结果也同样显示了抗CCP抗体的临界值为50AU/ml。并且RA患者清血清中抗CCP抗体的平均水平为1100AU/ml（范围为：57～3419AU/ml）。而对照组抗CCP抗体的平均水平仅为6.8AU/ml（范围为：1～39AU/ml）。进一步证实了抗CCP抗体对RA患者的诊断价值。
抗CCP抗体检测在判断病情与预后中作用的不同结果，可能与病例选择、样本量、判断阳性标准及病变程度不同有关，其在判断预后中的价值有待进一步观察。敏感度结果差距较大的原因可能与试剂本身的因素、抗CCP抗体存在的异质性以及选择病例的病程长短和骨质破坏程度的不同有关。
◆抗环瓜氨酸肽抗体的检测方法
目前国内外市场上的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒主要应用酶联免疫吸附法（ELISA法），它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比，可定性或定量检测患者血清中抗CCP抗体。其特异性来自抗体或抗原的选择性，抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。ELISA法检测具有特异性高、价格低廉的优点，但是一般采用手工操作，操作繁琐效率低，且人为影响因素大，结果只能定性或不精确地定量。因此，在这高效率的自动化时代，特异性高、操作简便的全自动化检测方法必将有良好的市场前景。目前国内已有体外诊断试剂公司开发出采用 “胶乳增强免疫比浊法”检测的抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒，并已投入临床应用。
免疫比浊法（Immunoturbidimetric Assays）是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加，通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。而“胶乳增强免疫比浊法”是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在直径为15－60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而在免疫比浊法的基础上提高试验的敏感性。相对于“ELISA法”，“胶乳增强免疫比浊法”操作简单，抗干扰性更强，且可测线性范围也更宽，能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。
◆研究展望
几年来国内外的临床检验实践表明，抗CCP抗体是检测RA较好的血清学指标，具有高度的特异性和一定的预后价值，被公认是RA的一个有价值的诊断指标，对判断病程也有参考意义。因此，不少学者提出修正1987年美国风湿协会修订的RA分类诊断标准，增加抗CCP抗体作为第8个标准，以更好地早期诊断RA，这也反映出抗CCP抗体检测的广阔应用前景。今后抗CCP抗体诊断RA的研究目标是提高敏感度，甚至达到100％，解决途径是应用多细胞系的强化抗原决定簇，多个肽的诊断效率更高。
此外，多种检测指标联合应用也有利于RA的诊断。有研究者认为，抗CCP与RF联合检测可显著提高RA的诊断率，对早期诊断和尽早治疗、改善预后有较高价值。在检测中,二者联合检测的阳性率,较任何只作单项检测均有统计学意义(P<0.01)；另外，二者联合检测可以为临床提供更多的信息,如疾病的活动性、病情的严重程度、指导临床用药等。
