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创新数据非依赖性采集用于复杂基质目标蛋白质...(二)

2020.5.18

肽段纳流液相分离的出峰时间一般在30 s 以上,因此在合适的循环时间内,3 种DIA 方法可以根据样本复杂程度灵活调节质量范围、分辨率、选择窗口等参数,达到最佳分析效果。例如,分析分子量较大的肽段时,质量范围可以调整为m / z 400 ~1200 或更宽。

 

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图1 基于Q-qIT-OT 的3 种数据非依赖性采集原理。(A)经典数据非依赖性采集DIA;(B)宽窗口SIM 扫描

DIA (WiSIM-DIA);(C)全扫描DIA (Full MS-DIA)

 

Fig. 1 Schematic illustrating quadrupole-ion-orbitrap (Q-qIT-OT) based three data-independent acquisition (DIA) methods. (A) Classic DIA, (B) Wide isolation window SIM scan DIA (WiSIM-DIA), (C) Full scan DIA (Full MS-DIA)

 

3.2 复杂基质加标样本的数据采集与分析

为了考察与比较3 种DIA 方法的分析效果,实验对Hela 细胞全蛋白酶解液中添加的10 条低浓度肽段进行了数据采集。10 条合成的标准肽段均来自于非人源的植物蛋白,分子量在1100 ~1700 Da 之间,具有高度特异性。标准肽段溶液使用100 mg/ L Hela 细胞酶解液逐级稀释为7 种浓度梯度,并逐一使用3 种DIA 方法采集(上样量1 滋L),考察方法的选择性、线性、重现性和灵敏度。图2 展示了50 mg/ L 浓度肽段样本的总离子流图(TIC)、目标肽段YLGYLEQLLR (m / z 634. 356, 2+)的提取离子流图(XIC)和子离子谱图(MS/ MS)。由于Hela 细胞样本高度复杂,标准肽段的色谱峰在TIC 中被完全掩盖。另外,相比WiSIM-DIA 和Full MS-DIA,DIA 只有二级扫描没有一级扫描,因此TIC 均由二级谱图构成,信噪比相对较低。进一步提取该肽段的XIC 图,其中DIA 基于子离子定量,选择最强子离子m / z 991. 557 形成634. 356 ~991. 557 母子离子对提取色谱峰;WiSIM-DIA 和Full MS-DIA基于母离子定量,利用母离子精确质量数m / z 634. 356 提取色谱峰。通过比较XIC 可以看出,在复杂Hela 细胞基质中,3 种方法均能有效排除干扰。

 

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图2  3种数据非依赖性采集分析Hela 细胞样本中的标准肽段。(A) DIA、(B) WiSIM-DIA 和(C) Full MS-DIA 的TIC 图、肽段YLGYLEQLLR 离子对XIC 图和MS/ MS 图

 

Fig. 2Analysis of standard peptides spiked in Hela cell digest by the three DIA methods. TICs, peptide YLGYLEQLLR XICs and MS/ MS spectra of (A) classic DIA, (B) WiSIM-DIA and (C) Full MS-DIA data

 

肽段YLGYLEQLLR 的出峰时间约为35 s,3 种DIA 在出峰时间内扫描点数均达到10 以上,分别为22, 14, 14,具有良好的色谱峰型和可靠的定量峰面积。

 

MS/ MS 谱图显示了3 种选择窗口下二级碎片离子的扫描结果。DIA 的选择窗口最大(20 amu),质谱峰最多,但Orbitrap 高分辨扫描能够有效区分碎片离子,因此谱图具有良好的信噪比,可以有效用于定性与定量分析。WiSIM-DIA 窗口缩短为12 amu,但属于线性离子阱低分辨扫描,因此质谱峰的区分能力相对较弱,造成一定干扰。Full MS-DIA 窗口仅3 amu,与DDA 相当,把基质干扰降到了最低,提供了良好的定性确证信息。

 

3.3 方法的线性灵敏度的考察与比较

 

数据进一步使用Pinpoint 1. 4 软件处理,考察方法在100 ng 复杂Hela 细胞基质下,20 ~200 pg 低浓度肽段范围内的线性、重现性和灵敏度。并以10 条标准肽段的PRM 数据鉴定结果作为谱图库,进行谱图匹配和定性确证。DIA 选取标准谱图中强度最高的8 个子离子作为定性确证依据,并提取其中最好的2 个y 离子进行定量分析。WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 同样选取最强的8 个子离子进行定性确证,定量分析则使用一级母离子的单同位素峰和相邻的第一个同位素峰。

 

以肽段YLGYLEQLLR ( m / z 634. 356, 2+) 为例, DIA 数据选取最强的y8 ( m / z 991. 557) 和y6 (m / z 771. 472)作为定量离子对,绘制标准曲线(图3A)。曲线在100 fg ~ 50 pg 范围内显示出良好的线性,同时, 8 个定性确证离子与谱图库中的标准谱图高度匹配,强度比例一致。WiSIM-DIA 选取单同位素峰M (m / z 634. 356)和相邻同位素峰M+1 (m / z 634. 857)进行定量分析,在100 fg ~200 pg 范围内具有良好的线性关系(图3B)。WiSIM-DIA 二级为低分辨扫描,易受基质和共流出肽段碎片的干扰,但由于选择窗口较小,因此也显示出良好的子离子谱图匹配结果。Full MS-DIA 定量流程与WiSIM-DIA完全一致,方法在500 fg ~200 pg 范围内显示出良好的线性关系,同时定性确证结果良好(图3C)。

 

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图3 肽段YLGYLEQLLR 使用3 种数据非依赖性采集的定性定量结果。(A) DIA、(B) WiSIM-DIA 和(C) Full MS-DIA 的定量离子对XIC 图、标准曲线和谱图匹配确证图。匹配确证柱状图从左到右依次为0. 5, 2, 10, 50 和200 mg/ L 和标准谱图

 

Fig. 3 Confirmation and quantification of peptide YLGYLEQLLR using the three DIA methods. Quantification ion XICs, standard curves and spectra library matching charts of (A) classic DIA, (B) WiSIM-DIA and (C) Full MS-DIA data. The columns of spectra library matching charts represent 0. 5, 2, 10, 50 and 200 mg/ L and library spectrum from left to right, respectively


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