缬沙坦干预单侧输尿管结扎大鼠肾纤维化作用的实验研究

缬沙坦干预单侧输尿管结扎大鼠肾纤维化作用的实验研究＊
赵燕云1 , 黄笑夏1 , 赵依娜1 , 刘张红2 , 胡振奋2 , 董飞侠2(浙江中医药大学附属温州中医院 温州 325000)

摘要:目的 探讨缬沙坦(V alsartan , Val)对单侧输尿管结扎(unilate ral ureteral obstruction , UUO)大鼠肾间质纤维化的影响及其药学作用机制。方法 18 只 SD 大鼠制作 UUO 模型后随机分为 3 组, 缬沙坦组给予缬沙坦灌胃治疗, 假手术组、模型组给予生理盐水灌胃治疗。 4 周后腹主动脉采血, 检测血浆血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ , Ang Ⅱ), 取 U UO 侧肾组织, 行M asson 染色观察肾小管间质病变, 免疫组织化学染色观察 a-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin , a-S M A)和转化生长因子-β1(t ransforming grow th factor-beta 1 , TGF-β1)在肾小管间质的表达, 并运用图像 分析系统进行半定量分析。 结果 缬沙坦可以显著减少血浆 Ang Ⅱ的含量(P <0.01), 下调 a-S M A 和 TG F-β1 的表达(P <0.01), 减轻肾间质纤维化的程度(P <0.01)。 结论 缬沙坦可能通过阻断 Ang Ⅱ的生成, 抑制 TG F-β 1、a-SM A 的表达, 从而达到抑制肾纤维化的作用。

关键词:血管紧张素Ⅱ 受体拮抗剂;单侧输尿管梗阻;a-平滑肌肌动蛋白;转化生长因子-β 1;肾间质纤维化
中图分类号:R969 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2011)-12-0028-03


Effects of valsartan on renal interst it ium fibrosis with unilateral ureteral obstruction in rats
ZHAO Yan-Yun1 , HUANG Xiao-xia1 , ZHAO Y-i Na1 , LIU Zhang-Hong2 , HU Zhen-Fen2 , DONG Fei-Xia2(Department
of Pharmacy , Wenzhou Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine 325000 , Chi-
na)

ABSTRACT:OBJECTIVE To explore the Valsartan on unilateral ureteral obstruction (unilate ral ureteral ob- struction , U UO)in rat renal interstitial fibrosis ａnd i ts pharmaceutical mechanism of action.METHODS 18 SD rats af ter U UO model w ere randomly divided into sham operation group , model group , valsartan g roup , valsartan g roup w ere given valsartan gavage t reatment , sham operatio n group , model g roup , no rmal saline gavage thera- py.A f ter 4 w eeks , to acquire abdominal aortic blood to detect plasma angio tensin Ⅱ , ａnd take U UO kidney tis- sue.Masso n staining to detect tubulointerstitial lesions ａnd immunohistochemical staining of alpha-smooth muscle actin (a-SMA)and t ransforming g row th facto r-β1(T GF-β1)in the ex pression of tubulointerstitial , ａnd through image analysis system to com plete semi-quant itative analy sis.RESULTS Plasma Ang Ⅱ levels was reduced sig- nif icantly by Valsartan (P <0.01), ａnd a-SMA ａnd TGF-β1 expression w as reduced (P <0.01), the ex tent of re- nal interstitial f ibrosis w as reduced (P <0.01).CONCLUSION Valsartan may be by blocking the formation of Ang Ⅱ , inhibit TG F-β1 , a-SMA ex pressio n , so as to achieve suppression of renal fibrosis.
KEY WORDS :Angiotensin Ⅱ receptor antagonist;Unilateral ureteral obstructio n;Alpha-smoo th muscle actin ;T ransfo rming g rowth factor-beta 1;Renal interstitium fibrosis



缬沙坦(Valsar tan)不但具有稳定的降压作用, 而且在改善肾小管间质损伤上具有一定的效果。 缬沙坦能否影响

TGF-β1 信号传导途径的表达, 进而影响肾间质纤维化的发生、发展。 该研究利用单侧输尿管结扎(U UO)模型探讨血管



作者简介:赵燕云, 女(1973 -)。 主管药剂师, 主要从事临床药学以及实验研究。
通讯作者:董飞侠, 男(1971 -)。 副主任中医师, 医学博士, 美国贝勒医学院肾脏系高级访问学者, 主要从事慢性肾脏疾病的理论以及临床研究。联系电话:13587638576 , E-mail :cgrsfht d @163.com
注:a.该研究包括作者署名无潜在利益冲突, 无经济利益以及其他利益冲突。 b.1.药剂科 2.肾内科
＊温州市卫生局科学基金项目资助, 项目编号:2009A 012 ;温州市卫生局科研项目资助, 项目编号:2010A 012 ;温州市科技局科学基金资助, 项目编号:Y20100222 ;浙江省 151 人才专项科研基金, 温州市 551 人才专项科研基金资助。


Strait Pharmaceutical Journal Vol 23 No.12 2011



紧张素Ⅱ 1 型受体拮抗剂对小鼠肾脏的保护作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物 清洁级雄性 SD 大鼠 18 只, 体重 180±20g , 在温州医学院实验动物中心饲养, 人工光照, 阴暗各 12h, 自由饮食。 动物许可证号:SYXK(浙)2005-0061 。
1.2实验药物与试剂 缬沙坦胶囊(北京诺华制药公司, 药准字 H20040217);Ang Ⅱ 放免试剂盒(上海劲马生物科技有限公司);鼠抗人 TG F-β1 、a-SM A 单克隆抗体;山羊抗鼠 IgG抗体(美国 SAN TA CRUZ 公司);免疫组化检测试剂盒、DA B显色剂(武汉博士得生物科技公司)。
1.3造模与分组 模型制作:用 3 戊巴比妥钠按 0.15mL· kg -1 的剂量麻醉大鼠后, 行左侧输尿管结扎术。 步骤:背部肋脊角处做一纵行切口, 长约 2～ 3cm(与背部正中线平行), 夹住脂肪组织 , 取出肾脏, 将其翻向脊柱侧, 以生理盐水纱布覆
2
结果
M asson 染色显示假手术组肾脏未见明显病变(见图 1A , 表 1);U UO 术后第二十八天, 梗阻侧肾组织肾小管间质大部分已纤维化(见图 1B, 表 1), U U O 组与假手术组比较有非常显著统计学意义 P <0.01 ;缬沙坦组部分近端小管上皮细胞空泡变性, 管腔内可见脱落坏死的上皮细胞, 远端肾小管扩张。 但是纤维化程度较 U UO 组轻(见图 1C , 表 1), 二者比较有非常显著统计学意义 P <0.01 。免疫组化显示假手术组大鼠肾间质只有极少量的 T GF-β1 、α-SM A 阳性表达(见图 1D 、图 1G , 表 1), 模型组大鼠 TG F-β1 、α-SMA 阳性表达与假手术组比较显著增多(见图 1E、图 1H , 表 1)(P <0.01);缬沙坦组 TGF-β1 、α-SM A 阳性表达也较模型组明显减少(见图 1F 、图 1I , 表 1)(P <0.01)。
表 1 3 组病理 M ASSON 染色以及Ang Ⅱ 、TG F-β1 和α-SM A 比较

盖, 暴露肾蒂, 分离出输尿管, 12 只在中 2/ 3 与下 1/ 3 处, 用 0
号线上下结扎两次, 中间剪断输尿管。 提起切口处皮肤肌肉,


组别 纤维化指数

Ang Ⅱ (ng·L -1)

α-SM A
(阳性 )

TG F-β 1
(阳性 )

使肾脏回纳原位, 分层缝合肌肉、皮肤层, 随机分为模型组予以生理盐水 1 日 1mL 灌胃;缬沙坦组为成人单位剂量的 10倍(给药量为 12mg/ (K g·d) ;假手术组 6 只:剖开大鼠腹腔,分离出左侧输尿管后, 不结扎, 分层缝合, 予以生理盐水 1 日1mL 灌胃。 疗程 1 个月。
1.4指标检测 在 U U O 术后治疗 4 周, 处死全部大鼠, 腹主动脉采血分离血浆,-80℃冰箱保存。 采用放射免疫分析法测定血浆 Ang Ⅱ 水平, 取冻存全部血浆标本, 严格按照上海劲马生物科技有限公司 Ang Ⅱ 放免试剂盒说明书冰浴下检测血浆Ang Ⅱ 水平。 所有标本均同批检测。 取术侧肾组织置于10 福尔马林固定液中, 石蜡包埋切片, 行 M asson 染色观察肾小管间质病变, 免疫组化染色观察 a-SM A 及 T GF-β1 在肾间质的表达, 并应用图像分析系统进行半定量分析。
1.5病理观察 肾组织 M asson 染色, 光镜观察。 在 PAS- 9000 高清晰度数码显微图像分析系统下计算肾小管间质纤维化指数。 高倍镜(×200)下随机选取 6 个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比, 进
行半定量评分。评分标准:0 分:无病变;1 分:<25 ;2 分: 26 ～ 50 ;3 分:>50 。 每张切片取 6 个视野的平均积分, 再在各组取平均值。
1.6免疫组织化学检测 免疫组化 T GF-β1 、a-SM A 采用 A BC 法:石 蜡切片脱蜡, 水化后, 用 0.075 胰酶于 37 ℃, 15min 或采用微波进行抗原修复, 一抗工作浓度为 1∶600 ～ 1000。 应用 DAB(二氨基联苯胺)显色。 常规脱水、透明、中性树胶封片, 镜检, 在 400 倍光镜下观察、记录免疫组化结果, 棕黄色为阳性染色。 在每张切片不包含肾小球和血管的间质区域随机选取 20 个高倍镜视野(X200, HPF), 用 Niko n E- clipse 80i Nis-Elements image softmare 分析系统对所选取视野中免疫组化阳性信号进行图像分析 , 计算每个视野中阳性染色面积占总视野面积的百分比。
1.7统计方法 实验数据以(x ±s)表示, 多组间比较采用单因素方差分析(one-w ay ANO VA), 所有统计学处理均由 SPSS 16.0 软件完成, P <0.05 为有统计学意义。


假手术组 0.23 ±0.06 453.6 ±63.83 10.16 ±1.28 10.18 ±1.39模型组 3.69 ±0.39 ＊ 1385.3 ±91.48 ＊ 68.39 ±5.53 ＊ 65.66 ±6.87 ＊缬沙坦组 1.52 ±0.37 # 856.4 ±75.56 # 30.15 ±3.98 # 30.54 ±5.69 #

注:与假手术比较＊P <0.01 ;与模型组比较#P <0.01 。


3讨论
3.1肾素-血管紧张素系统(renin-angio tensin system , RAS)被激活是导致肾纤维化的主要因素。 Ang Ⅱ 是这一系统中造成肾脏损害的主要物质, 参与调节血压、肾小球滤过与肾小管重吸收, 同时能够促进细胞外基质的积聚, 肾小管间质纤维化时, 系膜细胞合成增多, 进而肾脏局部的 Ang Ⅱ 活性增高, 通过直接或间接诱导 TG F-β1 的表达, 刺激肾脏局部单核细胞
趋化蛋白-1(mono cy te chemoattractant protein, M CP-1)和 Ⅰ 型
-纤溶酶原激活物抑制剂(plasminog en activator inhibitor , PA I- 1)的表达, 促进肾小管间质成纤维细胞的增殖、分化, 导致大量单核巨噬细胞浸润肾小球, 细胞外基质成分合成增多, 降解减少, 显示 RAS 在肾小管间质纤维化发病机制中发挥着举足轻重的作用, U UO 造成的大鼠肾间质纤维化很可能是由 Ang Ⅱ 在肾组织的生成增多所致, Ang Ⅱ 拮抗剂能明显降低 TGF- β1 mRNA 和Ⅳ型胶原 m RN A 的表达〔1 ～ 5〕。 还有有研究证实抑制 RAS 的药物如血管紧张素转换酶抑制剂(angio tensin...........想要阅读全文，欢迎联系我司业务员领取哦！