由于外界创伤引起的异位骨化是一种常见的临床疾病。研究异位骨化的分子机制和分子标签有助于异位骨化的早期诊断和临床治疗。来自上海交大附属第六人民医院范存义实验组的孙仰白博士等人发表在nature子刊《Scientific reports》上的文献，向我们阐明了miRNA信号通路在异位骨化中的作用机制。

　　研究背景

　　外界创伤，手术或者疾病会引起软组织的骨化过程导致异位骨化（Heterptopic ossification HO）。异位骨化可以分为三种不同的类型：进行性肌肉骨化症（FOP），创伤性骨化症（traumatic HO）和神经性骨化症（neurogenic HO）。然而，目前还没有一种有效的手段在早期对异位骨化做出判断，进而为控制骨化过程采取必要措施。因此，研究并寻找异位骨化过程中特异的分子标签，探究其的分子作用机制显得格外重要。本研究从miRNA的角度出发，研究了创伤性异位骨化过程中miR-630的重要调控作用。

　　研究结果

　　1.创伤性异位骨化的细胞来源鉴定

　　通过免疫组化（IHC）和H&E(hematoxylin-eosin)染色分析创伤后的HO患者骨组织样本，研究人员对不同时期的异位骨化样本进行了鉴定。然后，通过对内皮细胞makers vWF，E-cadherin和CD31及成骨marker的免疫荧光双标记，研究人员发现其在未成熟和成熟的HO细胞中都有表达。因此，内皮细胞是异化骨细胞的来源。

　　2.异位骨化特异性miRNA筛选

　　为了寻找表皮细胞转化而来的异位骨化过程中可能起调控作用的miRNA，研究人员对成熟HO阶段和非成熟HO阶段的病人血清样本进行了全基因组miRNA（该研究中Agilent Human miRNA microarrays (8*60K), 19.0芯片服务由伯豪生物提供）筛选，发现了一些上调与下调的miRNA。其中，miR-630已有报道是和EMT转化和软骨分化相关。因此，研究人员对miR-630进行了进一步的验证和分析。结果显示，相比于正常人，非成熟HO和成熟HO病人的miR-630分别下降20倍和10倍。所以，miR-630可能是一个潜在的HO早期诊断marker。

　　3.内皮细胞HO过程中miR-630的作用

　　BMP4和TGF-β2是已知的诱导内皮细胞-间质细胞转化（EndMT）诱导因子。因此，研人员用这两个诱导剂处理，诱导HD-MVECs的EndMT。结果显示，诱导2个weeks后，miR-630表达显著下调。同时内皮细胞marker VE-cadherin，occludin下调，间质细胞marker N-cadherin和vimentin表达增加。FCM分析也显示，MSC-like marker CD90和CD44及CD34和CD45表达也发生改变。但是，当转入miR-630 mimics时，CD90和CD44又能恢复。因此，miR-630抑制EndMT过程。Western blot实验也验证miR-630过表达时，VE-cadherin，occludin上调，N-cadherin和vimentin表达下调。

　　此外，通过对BMP4和TGF-β2诱导的人HD-MVECs进行ALP和alizarin red S染色，研究人员进行了成骨细胞分化检测。结果显示，miR-630 KD可以显著增加成骨细胞分化，上调成骨相关基因表达，而miR-630过表达有相反表现。因此，miR-630抑制HO过程中的骨生成。通过对诱导HO过程中的小鼠X-ray检测也得到了同样的结果。射线密度和骨体积分析显示，过表达或者KD miR-630可以抑制和促进骨密度和体积。因此，该结果表明，miR-630下调对HO相关的EndMT过程，及MSC-like表型的出现都密切相关。

　　4.miR-630作用靶基因鉴定

　　 既然miR-630调控HO过程，那么，它的作用靶基因是哪个呢？通过PicTar和TargetScan预测，发现Slug可能是其靶基因。对Slug的3’UTR区进行突变，处理miR-630 mimics，报告激团检测发现miR-630可以显著降低对照Slug的表达。同时，异位表达miR-630可以显著下调Slug的mRNA和蛋白表达水平，抑制BMP4和TGF-β2引起的Slug上调。因此，Slug是miR-630的直接调控靶基因。

　　为了进一步验证上述调控过程，研究人员进行了补救实验。过表达Slug可以颠倒miR-630诱导的内皮markers上调和间叶细胞marker下调，补救由于miR-630抑制HO过程中小鼠的后肢矿物沉积。骨密度和体积检测也显示，Slug可以补救miR630的抑制作用，修复Osteocalcin，osteopontin和Runx2表达下调。因此，miR-630对EndMT的抑制和骨生成抑制是通过直接调控Slug实现的。

　　5.血清中miR-630的表达是HO诊断的标签

　　为了探究miR-630的临床诊断价值，研究人员对创伤引起的HO患者和无HO的对照Ctrl1及骨折愈后患者Ctrl2进行血清中miR-630检测。结果显示，创伤8个小时后，miR-630的表达显著低于Ctrl1和Ctrl2。出现骨异位，手术3个月后，miR-630在HO中显著减少，术后1年，在三组病人中已没有明显差别。ROC曲线分析显示，HO病人的AUC相比非HO病人分别为0.892和0.912。分别以1.25作为分界点，HO相对Ctrl1和Ctrl2的特异性和敏感性都在80%以上，预测能力能达到70%左右。因此，血清中的miR-630表达可以作为HO的诊断标签。

　　研究结果

　　本研究通过对HO病人血清miRNA检测，找到了HO相关的特异性miR-630，后期运用小鼠模型检测验证了其生物学功能和下调靶基因Slug。最后，通过对病人血清的miR-630表达检测和分析，提出来miR-630作为临床早期诊断的可能性。该研究是一篇集合基础和临床运用的研究，值得我们广大科研工作者参考。

　　原文出处: Sun Y, Cai J, Yu S, Chen S, Li F, Fan C. MiR-630 Inhibits Endothelial-Mesenchymal Transition by Targeting Slug in Traumatic Heterotopic Ossification. Sci Rep.2016,6:22729.

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