免疫血清的制备实验
免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等),也可供特异性免疫治疗用。(来源:医学基础免疫学实验指导,主编金伯泉李恩善,第1 版,北京:世界图书出版社,1990)
实验方法原理 | 具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别,因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体,实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外,抗体的产生具有回忆应答的规律性,现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、免疫方法 三、分离血清 将三角烧瓶的血置37 ℃温箱1 小时,再置4 ℃冰箱内3~4 小时。待血液凝固血块收缩后,用毛细滴管吸取血清。于3000 rpm离心15 分钟,取上清加入防腐剂(0.01 %硫柳汞或0.02 %叠氮钠,最终浓度),分装后置4 ℃冰箱中保存备用。 展开 |
注意事项 | 1. 免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大,因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外,不能使用妊娠动物。 2. 免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射,否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后,置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900 转/分,振幅6 mm);后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后,吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1 小时即可使抗原充分乳化。 3. 佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清,但若抗原不纯时,可使抗原中极微量的污染物(0.005 mgN)产生抗体,以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外,有些实验动物种系对BCG过敏,尤其是豚鼠其次是家兔,当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此,第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂,以减少和防止变态反应的发生。 4. 抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少,免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下,一次注入的总剂量以0.5 mg/kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10 倍。另外,免疫周期长者可少量多次注射,免疫周期短者可较大量少次注射。 5. 免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6 点皮下注射,同时于两侧肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一处。每点注0.2 ml,间隔2 周后再于上述部位选不同点同上注射,也可产生高效价的免疫血清。 展开 |
其他 | 一、结果鉴定 以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价,并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量,应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。 |