刘虎威、白玉发文:脂质组学分析中样品前处理研究进展

2020年1月13日 10:46:41 来源: 《色谱》
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  近日,《色谱》期刊责任副主编刘虎威、青年编委白玉等人发文:脂质组学分析中样品前处理技术的研究进展

脂质组学分析中样品前处理技术的研究进展

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  作为代谢物的一大类重要组成部分, 脂质在生命体中扮演着重要作用, 如磷脂双分子层是构成细胞膜的基本骨架, 可维持细胞的完整性和相对独立性; 脂肪酸和甘油三酯是多种细胞的能量来源, 维持细胞的基本活动与功能; 许多脂质分子如类花生酸、溶血磷脂、内源性大麻素等可作为二级信号传递分子, 参与细胞信号传导等。脂质组学作为代谢组学的一个重要分支, 是对脂质及其相关结构与功能进行研究的科学, 其定义为“对脂质分子种属及其在生物学上的作用, 涵盖脂类代谢、功能蛋白质表达以及基因调控等因素的全面描述”。

  目前, 质谱(MS)已成为脂质组学研究中最有效的技术手段之一。基于MS的分析方法主要可分为3种:利用MS直接进样检测的“鸟枪法”, 与其他分离技术如液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、毛细管电泳(CE)等结合的联用方法, 以及可实现样品空间分布的质谱成像(MSI)方法。脂质组学研究对象通常是基质复杂的生物样品, 如血清、血浆、尿液、组织等, 除MSI方法外, 在进行分析前往往需要对样品进行富集和提取。提取后的脂质在MS检测时可能仍会面临灵敏度低等问题, 这就需要对样品做进一步处理, 化学衍生化是解决该类问题的有效手段之一。本文针对脂质组学分析中的样品前处理技术, 以脂质化合物提取方法与衍生化技术为重点进行了评述, 并对其发展趋势进行了展望。

1脂质的提取与富集技术

  通常生物样本采集后直接利用液氮快速冷冻, 之后放入低温(如-80 ℃)环境储存, 从而尽量减少样品中各类物质发生改变。在进行分析前, 液体样品在4 ℃条件下复溶, 然后进行充分混合; 固体样品则可借助研钵或匀浆机, 通过加入适当溶剂完成混合。

  常用的脂质提取技术主要包括液液萃取(LLE)与固相萃取(SPE)两种方式。由于LLE可提取出较为全面的脂质分子, 适用于非靶向全脂分析; SPE过程使样品经过分离和富集步骤, 进一步除去干扰物质, 提高被分析物的浓度, 更适用于某一类或某几类脂质分子的靶向代谢组学分析。

  1.1 液液萃取

  生物样品中蛋白质的存在会影响脂质分析方法的精确度与准确性, 如不提前去除, 可能缩短仪器的使用寿命。为了减少样品损失, 前处理步骤应尽可能少, 相对简单的操作是将蛋白质沉淀与脂质提取一步完成。

  LLE是脂质组学中使用最广泛的萃取方法。与单相溶剂萃取体系不同, LLE利用被分析物在两种互不相溶的溶剂中分配系数的差异实现不同物质的分离。脂质组学分析中应用最多的LLE方法有3种:Folch法、Bligh-Dyer法和Matyash法。其中Folch法使用氯仿-甲醇-水(8:4:3, v/v/v)混合溶剂对生物样品进行全脂提取, Bligh-Dyer法在上述方法的基础上进行了改进, 使用相同溶剂体系但不同体积比(2:2:1。8), 以此减少溶剂用量, 缩短提取时间, 并且还可减少有毒试剂氯仿的使用。氯仿与甲醇的混合体系能在多种复杂基质中非选择性地提取出各种脂质分子, 水相的加入可以增强相分离, 减小脂质在水相中的溶解度, 从而提高萃取效率。

  1.2 固相萃取

  SPE是利用不同物质在固液两相中相互作用的差异实现分离的, 其具体操作是先使被分析物吸附到固定相上, 然后使用不同洗脱能力的溶液(流动相)分步洗脱, 实现样品的分离、纯化与富集, SPE常被用于脂质的萃取。一般来说, SPE常用于LLE之后, 目的是去除萃取液中的干扰物质或特异性富集某一类或某几类脂质, 以用于靶向脂质组学分析。

  相对于SPE, 固相微萃取(SPME)使用溶剂量少, 分析速度快。SPME常使用一根带有涂层的纤维用于萃取分析物, 基于静电作用、离子交换作用、疏水相互作用等作用力, 目前使用较多的涂层有聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚苯胺(PANI)等。

  SPME技术常与GC或GC-MS结合用于挥发性物质的分析, 如顶空-GC(HS-GC)的进样针首先在一定条件下对固体、液体或气体样品进行萃取吸附, 进而在进样口实现洗脱/解吸附并完成进样。此外, SPME也可与全二维GC(GC×GC)分析结合, 借助高灵敏的质谱检测技术用于环境污染物和农用化学品的检测。目前, SPME结合GC-MS已成功用于多种样品中脂肪酸或脂肪酸酯的分析, 如水果、牛奶、白酒等。尽管SPE/SPME方法所用小柱或涂层容易达到饱和, 成本较高, 但具有样品和溶剂消耗少、分析速度快、易于自动化的优点, 适用于极少量样品、大规模样品及原位分析。

  1.3 其他萃取技术

  近年来, 除了LLE与SPE方法外, 许多其他方法也已用于脂质组学样品前处理中, 如微波辅助提取法(MAE)、超声辅助提取法(UAE)、超临界流体提取法(SFE)等。MAE主要利用微波的能量在萃取过程中提高温度和压力, 从而加快萃取速度, 提高萃取效率, 并且减少有机溶剂的用量。由于萃取过程中温度的升高, MAE可能造成热不稳定性物质的分解。

  UAE是利用超声波产生的机械振动、扩散等效应加速两相间物质传递, 从而实现萃取的技术。与MAE不同的是, UAE过程中不会升温, 有利于热不稳定性物质的分析。此外, UAE可与LLE相结合, 进一步提高样品中被分析物的萃取效率。

  超临界流体是指温度与压力均处于临界值以上的流体, 具有低密度与高扩散性的特点, 适合于样品的萃取或分离。SFE中最常用的超临界流体是CO2, 其临界压力(7。4 MPa)与温度(31 ℃)均较低, 并且无毒害, 易于去除。超临界CO2的极性与戊烷相近, 适合于疏水性物质的萃取。用甲醇、二氯甲烷或水作为添加剂, SFE也可用于极性物质的萃取。

2脂质的化学衍生化技术

  经过样品提取的脂质在检测过程中可能面临如下挑战:由于脂质分子种类多样, 化学性质有所差异, 使得不同脂质分子在MS检测过程中离子化效率差异显著; 脂质分子的动态分布范围较宽, 离子化过程中存在离子抑制效应; 仪器对低浓度物质的检测灵敏度不足; 用于定量的脂质内标分子不易获得; 脂质分子存在大量同分异构体, 定性定量困难等。对脂质样品进行化学衍生化处理可能是解决这些问题的有效手段之一。在脂质组学分析中选择合适的衍生化方法, 有利于实现离子化效率的提高, 检测灵敏度的提升, 化合物结构稳定性的增强, 甚至同分异构体的区分等。

  2.1 针对脂质双键的衍生化反应

  对于脂质分子的结构确证, 通常基于常规的二级质谱图, 即通过一些特征碎片得到脂质类别、碳链组成及碳链位置信息。但是, 碳链中不饱和双键的位置信息却难以获得。这主要是由于常规的碰撞诱导解离(CID)方式能量较低, 无法达到断裂碳碳双键所需要的能量要求。

  臭氧诱导解离(OzID)是一种可以鉴定单/多不饱和脂质的有效方式。OzID利用离子化的脂质与中性的臭氧分子在质谱内发生气相离子-分子反应, 从而产生带有双键位置信息的碎片。由于仪器限制, 向质谱内部传输的臭氧浓度较低(约109~1012分子/cm3), 因此需要较长的反应时间(~1 s)才能达到检出信噪比要求, 这就限制了OzID与快速LC的联用。最近的研究表明, 提高质谱反应区域内臭氧的密度, 可以显著提高OzID的循环周期。当臭氧分子密度达到~1015分子/cm3时, OzID的反应时间可以减小至100 ms以下, 使得OzID的循环周期与质谱匹配, 并可以结合LC的分离能力进行脂质组学分析。Poad等通过改造离子淌度-飞行时间质谱(IMS-QTOF)的捕获离子漏斗, 在IMS分析前发生臭氧化反应, 并结合LC建立LC-OzID-IMS-MS方法, 实现了脂质双键位置的鉴定。尽管OzID在分析混合物时有巨大的应用前景, 但该方法目前没有专用仪器, 通常需要特殊的质谱仪器或对仪器进行改造, 因而使其应用受到限制。

  近几年来利用化学反应, 如臭氧化和PB反应衍生等, 在脂质不饱和键位置的鉴定方面开展了一系列创新性的研究工作, 解决了长期困扰脂质组学研究中脂质不饱和键位置鉴定困难的问题。上述反应是较为通用的双键加成反应, 理论上适用于所有不饱和脂质的分析, 但由于反应效率相对有限, 在低丰度不饱和脂质分析中仍面临挑战。

  2.2 针对脂质极性头基的衍生化反应

  衍生化反应通常需要根据研究目的及待测物上的活性基团, 选择合适的衍生化试剂。在此基础上, 为提高定量的准确性, 进一步发展出了稳定同位素标记衍生化(SILD)方法, 其原理是分别用轻质和重质同位素标记的衍生试剂与样品和标准品反应, 按一定比例混合后进样, 根据结果中轻标和重标衍生产物的比值即可对相应组分进行相对定量。与常规衍生化方法相比, SILD有利于解决样品基质干扰严重、内标不易获得等问题, 从而提高定量准确性。

结论与展望

  综上所述, 合适的样品前处理方法在脂质组学研究中至关重要, 它不仅决定组学数据的质量, 方法的检测灵敏度, 甚至包括方法的应用范围。发展样品中全脂的提取方法是非靶向分析的关键; 对于脂质的靶向分析, 选择性的脂质提取通常需要多种方法相结合, 如LLE与SPE等。减少有机溶剂用量、使用低毒或无毒溶剂、操作简便快速、提高萃取效率、提升自动化水平等已成为脂质提取方法的发展趋势。针对样品中不易检测的物质, 化学衍生化提供了一种可行的策略。该策略中, 衍生化试剂的确定及合成方法是关键, 也决定了方法的实用性和可推广性。因此, 新型、普适性或特异性的衍生化试剂的开发成为主要发展方向, 需兼顾试剂原料易得性、合成条件温和、反应速度快、效率高等特点。不同类型的脂质及其表达量与诸多疾病密切相关, 优良的样品前处理技术对于提升脂质组学数据质量、研究脂质生理功能、发现脂质相关疾病标志物等研究提供重要的技术支撑, 对脂质组学的发展具有重要意义。

  宋诗瑶, 白玉*, 刘虎威

  色谱, 2020, Vol. 38 Issue (1): 66-73

  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.07011

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