微生物学实验室的主要仪器设备（二）
下面以普通光学显微镜为例，简单介绍一下显微镜的结构、原理等。
1. 基本构造
普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分组成（如图1.1）。机械装置由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调焦装置（粗调焦螺旋和微调焦螺旋）等组成。光学系统包括物镜、目镜、聚光器、彩虹光阑和光源等。
2. 成像原理和性能
普通光学显微镜的成像原理如图1.2所示。将被检物体置于集光器和物镜之间，平行的光线自反光镜折入聚光器，光线经过聚光器穿过透明的物体进入物镜后，即在目镜的焦点平面（光阑部位或附近）上形成一个初生倒置的实像。从初生实像射过来的光线，经目镜的接目透镜而达到眼球。这时的光线已变为或接近平行光，再透过眼球的水晶体时，便在视网膜后形成一个直立的实像。
显微镜的主要性能包括放大率、工作距离、焦点距离、焦点深度、分辨率、镜像亮度和视场亮度等。
（1）放大率
在显微镜组合中，光线通过物镜先将物体放大为一个左右相反、前后倒置的实像，经目镜再次放大为一个虚像，这一虚像的大小和物体大小的比例，就叫放大率。
显微镜的放大率 = 物镜的放大倍数×目镜的放大倍数
= （光学筒长/ 物镜焦距）×（明视距离/ 目镜焦距）
明视距离是已知数，物镜焦距和目镜焦距在说明书上有数据可查，而光学筒长是指物镜上焦平面到目镜下焦平面的距离，一般为160mm。
（2）工作距离
当显微镜调准焦距时，从盖玻片到物镜前透镜表面之间的距离叫工作距离。工作距离的大小和物镜的放大倍数与数值口径有关。物镜放大倍数和数值口径愈大，则工作距离愈小，反之愈大。表1.1表示标准物镜的主要性质。一般油镜的工作距离最短，约0.2mm。因此，要求盖玻片的厚度为0.17~0.18mm。若盖玻片过厚，就不可能将被检体聚焦，且易引起物镜的意外损坏。
表1.1标准物镜的主要性质
|
焦距（mm） |
光学筒长（mm） |
放大倍数 |
镜口率（NA） |
工作距离 |
|
16 8 4 2 |
160 160 160 180 |
10× 20× 40× 90× |
0.28 0.50 0.65 1.25 |
6.5 2.0 0.60 0.20 |
（3）焦点距离（焦距）
它是指平行光线经过单一透镜后集于一点，由这一点到透镜中心的距离。一个物镜通常有几个不同性质的透镜组成。因此，它的焦距的测定比较复杂。一般，显微镜的物镜上都注明焦距的长度。物镜的放大倍数越大，焦距越短。
（4）焦点深度
在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也可看清楚，这个清晰部分的厚度就是焦点深度。焦深与总放大率和数值口径成反比，因此，高放大率和高数值口径的显微镜其焦深就浅，不能看到标本的全厚度。必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。另外，被检物体周围介质（封片剂）的折射率加大可增大焦深。尤其在显微照相时，更应考虑封片剂的使用。
（5）数值口径（numerical aperture 简写为NA）
数值口径是指物镜与标本间介质折射率（n）和光线投射到物镜上的最大入射角（α）一半正弦的乘积。其计算公式为：
NA=n×sin(α/2)
其中，n=介质折射率，干燥系物镜n=1，油浸系物镜n=1.515；α=光线进入物镜的最大夹角，也称镜口角。
（6）分辨率
显微镜能够分辨物体结构中两点之间的最小距离的能力，就叫分辨率。分辨率与物镜的数值口径成正比，与光波波长成反比。因此物镜的数值口径愈大，光波波长愈短，则显微镜的分辨率愈大，被检物体的细微结构也愈明晰地区分出来。因此，一个高分辨率意味着一个小的分辨距离。显微镜的分辨率是用可分辨的最小距离（D）来表示的：
D=λ /（2NA）
（7）镜像亮度与视野亮度
镜像亮度是显微镜的图像亮度的简称，指在显微镜下观察到的图像的明暗程度。使用时，对镜像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼。镜像亮度与数值口径平方成正比，，与总放大倍数的平方成反比。
视场亮度是指显微镜下整个视场的明暗程度。视场亮度不仅与目镜、物镜有关，还直接受聚光镜、光阑和光源等因素的影响。在不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度大，镜像亮度也大。
3. 油镜的基本原理
油镜，也称油浸物镜，一般在镜头上标有“HI”和“HO”字样，或在镜头下缘刻有1~2道黑线作为标记。使用油镜时，需将镜头浸在香柏油中进行观察，这是为了消除光由一种介质进入另一种介质时发生散射，结果不仅提高了放大倍数，还增加了照明度和分辨率。
（1）照明亮度
油镜与其它物镜不同之处在于玻片和物镜之间的介质不是空气，而是一种和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）。如果玻片与物镜之间的介质是空气（n=1.00），光线通过玻片后发生散射，进入视场的光线显然减少，结果降低了视场亮度。当光线通过玻片又通过香柏油进入物镜就不发生散射，结果，提高了照明度，观察的标本显得更清晰（图1.3）
（2）分辨率强
使用油镜还能增加显微镜的分辨率。由于显微镜分辨率与物镜的数值口径（NA）成反比，与波长成正比。因此物镜的数值口径愈大，光波愈短，则显微镜的分辨率就愈大。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，加入数值口径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值口径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离为0.22μm。因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体，但大部分细菌直径在0.5μm以上，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态。
4. 注意事项
使用显微镜应注意以下事项：
（1）取拿显微镜时，必须用一手握住镜臂，另一手托住显微镜的镜座，使显微镜保持直立的状态，切忌用单手提拿。
（2）将显微镜放置桌上时，务必要轻轻放下。
（3）显微镜的镜头必须保持清洁，必要时用擦镜纸擦拭镜头，不可使用布或一般的纸，以免损伤镜头。
（4）将显微镜轻轻地放置桌上，镜座后缘位于离桌子边缘约5cm处。
（七）接种箱（Clean Box）
接种箱分为固体菌种接种箱和液体菌种接种箱两种。固体菌种接种箱是一个用木料和玻璃制成或由有机玻璃焊接而成的密闭小箱。又分为双人和单人操作箱。箱体可大可小，一般箱体长约143cm，宽86cm，总高154cm，支架76cm。箱的上部左右两侧各装有两扇能启闭的玻璃推拉门，方便菌种进出。窗的下部分别设有两个直径约13cm的圆洞，两洞的中心距离为52cm（同肩宽），洞口装有带松紧带的袖套，以防双手在箱内操作时，外界空气进入箱内造成污染。操作时两人相对而坐，双手通过袖套伸入箱内。箱两侧最好也装上玻璃，箱顶部为木板或玻璃。箱内顶部装有紫外线杀菌灯和照明用日光灯各一支。箱体安装木板或玻璃均可，但要注意密封。
液体菌种接种箱是专为移接液体菌种而设计的。比固体菌种箱窄长，单侧两人操作。内设轨道和紫外线灯，箱两端开有高25cm，宽10cm的长方形出口，方便菌种进出，洞口设有小推门。进出口下处设蒸汽源，接种时用蒸汽封住进出口，以防杂菌进入箱内。箱背面设有液体菌种移接管能进入的小孔。
接种箱灭菌时，用紫外线照射30min。如果没有紫外线灯，可用甲醛和高锰酸钾（甲醛10～14mL/m3+高锰酸钾5～7g/m3空间）熏蒸30min以上。使用时，先将所需物品和工具放入接种箱内，然后进行药剂熏蒸和紫外线灭菌，再按无菌操作进行接种。
接种箱的结构简单，造价低廉，易消毒灭菌，操作方便，而且人在箱外操作，气温较高时也能作业。缺点是进出培养基费工费时，每次接种前都需要进行灭菌。
（八）冰箱
微生物实验室的冰箱主要有两种：普通冰箱和低温冷冻冰箱。普通冰箱一般都具有两个柜子，即鲜藏柜和冷藏柜，温度分别为4℃和－20℃；低温冷冻冰箱温度一般控制在－40～－80℃。它们都可以用于微生物菌种保藏。鲜藏柜常用于保存斜面菌种，保藏时间在3个月左右。超过3个月，斜面就会变干，因此需要转接菌种。如果要长时间保存菌种，则需要经过处理后，贮藏于普通冰箱的冷藏柜或低温冷冻冰箱中，它们的保藏时间较长，一般都在1年以上。
