多光子共聚焦扫描显微镜的原理以及应用

多光子共聚焦显微镜是光学显微镜的重大改进，主要表现为可以观察活细胞、固定细胞和组织的深层结构，并且可以得到清晰锐利的多层Z平面结构，即光学切片，并以此可以构建标本的三维实体结构。共聚焦显微镜采用激光光源，经过扩充后充满整个物镜后焦平面，然后经过物镜的透镜系统，在标本的焦平面上会聚成非常小的点。根据物镜数值孔径不同，最亮照明点直径大小约0.25  ~ 0.8μm，深度约0.5 ~  1.5μm。共聚焦点大小决定于显微镜设计、激光波长、物镜特性、扫描单元状态设定和标本性质。场式显微镜的照明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微镜的照明则集中到焦平面上的一个精确的焦点上。共聚焦显微镜最基本的优点是可以对厚荧光标本（可以达到50   μm或以上）进行精细的光学切片，切片的厚度约为0.5到1.5μm。系列光学切片图像可以通过精确的显微镜Z轴步进马达上下移动标本获得。图像信息的采集被控制在精确的平面内，而不会被位于标本上其他位置发出的信号干扰。在去除背景荧光影响和增加信噪比后，共聚焦图像的对比度和分辨率比传统场式照明荧光图像有明显的提高。在很多标本中，许多错综的结构成分相互交织构成复杂的系统，仅用几张光学切片很难还原标本本身的结构特征，但是一旦能够采集到足够的光学切片，我们就能通过软件对其进行三维重建。这种实验方法已经被广泛应用与生物学研究中，用来阐明细胞或组织之间复杂的结构和功能关系。

与传统光学显微镜相比，多光子共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。在对生物样品的观察中，多光子显微镜有其优越性：对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。多维图象的获得，如7  维图象(XYZaλIt): xyt、xzt 和xt  扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察。对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。

当前，激光共聚焦显微镜较广泛应用的研究领域有：细胞生物学：如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞骨架与核改变之间的关系；细胞黏附行为等。生物化学：如酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确。药理学：如药物对细胞的作用及其动力学；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量。生理学、发育生物学：如膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；动物发育以及胚胎的形成，骨髓干细胞的分化行为；细胞膜电位的测量，荧光漂白恢复（FRAP）的测量等。遗传学和组胚学：如细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断。神经生物学：如神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递。微生物学和寄生虫学：如细菌、寄生虫形态结构。病理学及病理学临床应用：如活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断。免疫学、环境医学和营养学：如免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达。