重组杆状病毒的纯化实验

实验材料 杆状病毒

试剂、试剂盒 琼脂牛血清

仪器、耗材 培养瓶冻存管

实验步骤

1.  制备病毒上清的系列稀释液，该病毒上清获得自在无血清完全培养液中转染 pAC360β-gal DNA的细胞。在含150 μg/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物下病毒形成蚀斑。
 
2.  当蚀斑形成后，用灭菌巴斯德吸管挑取一个分离较好的蓝色蚀斑，并将琼脂糖块移入 一支含有1 ml 无血清完全培养液的无菌试管中。在旋涡混合器上剧烈篱荡，并用无血清完全培养液制备10-1、10-2和10-3的系列稀释液。
 
3.  用含150 μg/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物蚀斑测定病毒（有助于发现重组子），重复蚀斑试验，直到获得纯的重组病毒贮液。
 
4.  用无菌吸管挑取一个纯的重组蚀斑，将琼脂糖块移入一含2.5×106 Sf9细胞和5 ml 完全培养液（含10%胎牛血清）的25 cm2 培养瓶中。于27℃温育4~5天直到大多数细胞被感染。
 
5.  确定病毒滴度（应在5×107~1×108  pfu/ml之间）。
 
6.  加入1 ml 该毒种贮液于一支1.5 ml 螺口冻存管中，于-80℃可长期保存，于4℃保存剩余的液体（标记为初代毒种液）。从初代毒种液中生产大批病毒贮液并滴定之。