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[讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结
[讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结 (转载)[讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结
看到很多同学在问关于RAW264.7细胞的一些问题，基于我对该细胞一年的培养经历和以前我发的贴，现在索性总结一下关于该细胞的经验以及注意事项，希望能对大家有所帮助！
培养条件：1640培养液+四季青10%新生牛血清。PH：2gNaHCO3每1L 1640培养液。
在我培养的过程中，从来没有用过胰酶消化传代。我一直是直接用弯嘴滴管吹打的。只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。吹打一遍之后，置镜下观察哪里还有未吹下的细胞，再着重吹打。吹打过程中，注意用力，要比常规稍加力度以能够吹下细胞。当然，用胰酶消化也是可以的，但是细胞的生长状态就是没有不用直接吹打下来的好。
对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢扎堆的。正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。一般，在细胞小片小片地铺满瓶底而未连成大片的时候就该传代了。并且一旦有片细胞叠加成层就要进行传代。否则该处细胞必老化。影响整体生长状态！
该细胞的生长速度比较快，常规留种下，一般3-4天传代。有时生长旺盛的时候甚至2天就需要传代，所以在你传新瓶的时候，尽量少留种，我们在平时维持的时候，一般都是只在新瓶里用滴管口蘸一下而已。能够维持4-5天再传代。如果是一次性大塑料瓶，则可以维持7天左右。过节假日时可以用此方法维持。
RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形或多边形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。
RAW264.7细胞生长速度非常得快，贴壁速度很快，对生长空间的要求比较敏感。所以传代的时候以及培养的时候都要注意不要太多的细胞在培养瓶里，这样细胞状态会比较好。很多反而不利于该细胞生长。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该把我好该细胞喜欢的生长空间密度。
对于细胞生长状态不好的时候，可以采取“二传”的方法，是我在另一帖子里写到的，现在转述如下：
【对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：
首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）
其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。
如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。】
RAW264.7细胞本身就会呈不规则状的多边形，所以当细胞呈现这种形状的时候，不必大惊小怪，在培养瓶里多数细胞呈现出此种形状之时，其实就是提示你他的生长状态即将趋于不好了，有些老化了，该传代或者优化筛选了。
暂时总结这么多，后面有想到的会继续补充！另外一篇帖子“如何把细胞养的更漂亮！”大家可以补充着看。祝各位好运！
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最新回复
乌贼老弟 (2011-12-15 16:52:59)
以前我也养过，是用细胞刮刀将细胞刮下后传代，感觉不是很满意！下次试试LZ的方法！
zwsyrt (2011-12-15 16:53:28)
@STAR@ (2011-12-15 16:53:55)
现在RAW264.7的细胞是不是到处都有啊？我们实验室没呢。。。。
园丁## (2011-12-15 16:54:29)
二丫头466 (2011-12-15 16:54:57)
老化的细胞或者成层的细胞再传，会变好吗？谢谢！
loli (2011-12-15 16:55:32)
loli (2011-12-15 16:56:37)
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成片生长是因为传代的时候太稀了。传代密度稍微高一点就很均匀。
一般100mm dish 1:4 OR 1:5传代比较合适。
园丁## (2011-12-15 16:56:57)
所以临床各种不同的炎症就出现!
高于体温的外热如喝热水,能诱发血细胞的御热本能出现!肺大等免疫细胞与白细胞及吞噬细胞御热释放胞内热液,并邹缩减少面积而御热自保而进攻态停止而休息的储能态开始.这就是中医喝热水治疗外感发烧的原理!
abc816 (2011-12-15 16:57:17)
关于老化的问题，我赞成，也有教训。巨噬细胞RAW264.7一定不能太满，否则老化，对LPS等的刺激也不敏感了，所以我从来都是较稀的传代、铺孔做实验。以后再交流，很有收获的。
铜雀 (2011-12-15 16:57:41)
这个细胞很好养的，胰酶消化很方便，1640和dmem都能养，是我目前培养过的最好养的细胞
气泡 (2011-12-15 16:58:04)
由于细胞是从生物物理所引进的，所以培养方法沿用物理所的。
细胞用10％ FCS＋DMEM培养，细胞的形态应该是又圆又亮，要是长了触角，可能就说明已经分化了，不建议继续培养。大家可以参见ATCC的网站。
我们发现直接用培养基不能吹下细胞。由于细胞贴壁很牢，可以先去除培养基，再用生理盐水洗一遍，弃掉，再加入适量的生理盐水，轻轻把细胞吹下来。离心后用培养基重悬后，按比例传代。这样细胞很容易就能下来。
一般1：10传，细胞2-3天长满一皿（常规用培养皿培养便于吹吸细胞）。
不建议用胰酶消化，因为容易使巨噬细胞分化（物理所传授没有试验过）。
用的培养基一定要用不含内毒素的去离子水配制。避免细胞分化。我们现在用hyclone配制好的DMEM还可以，有条件的最好自己配制，现在的假冒培养基特别多。
loli (2011-12-15 16:58:44)
不用胰酶消化是RAW对胰酶消化有抵抗吧？
克隆鱼 (2011-12-15 16:59:41)
这个细胞属于单核/巨噬细胞，会在各种刺激下分化，成巨噬细胞样。因此在传代过程中要尽量避免各种刺激。所以经典的培养方法中推荐用热灭活血清，传代用细胞刮刀轻轻刮下，而不用胰蛋白酶消化。
如果反复刺激RAW 264.7细胞，在某些实验中，细胞的造模成功率会降低。比如在LPS诱导后Griess试剂法测定亚硝酸盐以考察细胞分泌一氧化氮，可能会失败。
另外，1640培养基中含有的硝酸盐很多，如果做硝酸还原酶偶联Griess试剂法检测总一氧化氮分泌量，培养基中的硝酸盐会被还原成亚硝酸盐，导致实验结果不准确。而且一般在Griess试剂法测定亚硝酸盐的实验中，要用无酚红培养基。
所以做炎症相关研究的同道尽量不要采用楼主推荐的方法，可能会走很多弯路。
zwsyrt (2011-12-15 17:00:32)
一般100mm dish 1:4 OR 1:5传代比较合适。
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巨噬细胞的本性就是小片扎堆生长，与密度的稀浓无关。巨噬细胞有细胞间信使系统互相调节的。
969 (2011-12-15 17:00:52)
ATCC上该细胞类型确实是用1640培养的，但我用GIBCO 的DMEM它也长得很好。
呵呵，胰酶消化也是可以的，0.125%，37度4分钟就OK了
zwsyrt (2011-12-15 17:01:26)
whitesheep (2011-12-15 17:02:19)
zwsyrt (2011-12-15 17:02:48)
ffooll (2011-12-15 17:03:10)
我想问一下在做实验中巨噬细胞RAW264.7和使用从血液中单核细胞分化而来的巨噬细胞有何不同？
zwsyrt (2011-12-15 17:03:33)
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