启动子克隆方法研究进展（3）
1.4 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子
这类方法的第一步都是酶切基因组DNA，连接载体或接头，既可以用pUCl8等质粒载体，也可以使用λDNA等噬菌体载体，只要选用的载体带有合适的酶切位点；同样根据实验需要，接头既可以是双链也可以是单链，然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。
1.4.1 利用载体的PCR Shyamala等利用的单特异性引物PCR(SSP-PCR)对以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步行。以M13mpl8RF DNA为载体。用PstI和AraI酶切基因组DNA，PstI和XmaI酶切载体DNA，然后连接基因组片段和载体片段，用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增，由于非特异片段没有单特异引物结合的位点，即使有载体连到非特异片段，也无法得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。
1.4.2 利用接头的PCR王新国等利用衔接头的方法，设计了位于单链DNA两端互补的颠倒末端重复序列，增加了反应的特异性，在胡萝卜II型转化酶基因启动子的克隆方面取得了新的进展。首先将胡萝卜基因组DNA分别用PvuI、SmaI、DraI、EcoRV酶切，并设计了1个衔接头长链序列和1个衔接头短链序列，并在衔接头短链的3'末端带有1个氨基的衔接头，能够阻止聚合酶催化的衔接头短链的延伸，同时衔接头的长链和短链之间是反向重复序列。将酶切片段与此衔接头连接，取连接产物做模板，以衔接头引物和基因特异引物做PCR，在首轮PCR中只有限定的远端基因特异引物有结合位点，当基因特异引物延伸产生的DNA链通过衔接头时，才能产生衔接头引物的结合位点，PCR才能以衔接头引物和基因特异引物进行指数扩增。而另一方面，如果非特异合成产生了DNA两端都有双链衔接头序列的PCR产物时，这种PCR产物在每次变性后，单链DNA末端的衔接头反向重复序列将形成锅柄结构，此结构比引物-模板杂交更稳定，能抑制非特异序列的指数增长。最后得到主要的PCR产物为3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。将EcoR V-衔接头体系的PCR产物克隆、测序、同源性比较，得到1个新的胡萝卜II型转化酶基因启动子序列，它含有类似于TATA box和CAAT box的元件，在启动子的远上游区域含多个AT富含区，该启动子的发现对于研究植物中的糖代谢具有重要的意义。接头引物的相对位置如图3所示。
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这种方法具有便于操作、实验线路简单的优点，但是特异性较差，产物需进一步杂交验证。
1.5 YADE法
Prashar等在扩增cDNA3'端时采用“Y”形接头，以减少接头引物的单引物扩增。
其原理是接头引物处于“Y”接头的2个分叉单链上，序列与接头一样，只有与特异引物引导合成了接头的互补序列后，接头引物才能退火参与扩增，流程如图4。
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方卫国等尝试将YADE法引入到昆虫病原真菌的分子生物学研究，并取得了成功，建立了适合于球孢白僵菌和金龟子绿僵菌YADE体系。在已克隆的类球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的基础上，利用YADE法，克隆到该基因的启动子CDEPP。
先酶切球孢白僵菌基因组DNA，然后与“Y”形接头相连，取连接产物做模板，先以基因特异引物1做线性扩增，再以线性扩增产物为模板，以接头引物和基因特异引物2做指数扩增，只有当线性扩增时合成了含有接头引物的互补单链，接头引物才能与其发生退火，参与指数扩增，从而有效防止了接头引物的单引物扩增。最后得PCR产物，进行序列分析确定为CDEP-1的上游启动子序列。
在应用YADE法时，内切酶的选择至关重要。好的内切酶产生适合PCR扩增的片段，太大太小都不行。为了得到合适的内切酶，需要从众多的内切酶中筛选。研究表明，不同的物种有自己合适的内切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因组 DNA片段，也可以是cDNA片段，在延伸cDNA片段时，设计的引物需要避开内含子和外显子的边界，在内含子的位置未知的情况下，可考虑多合成1～2条特异引物，以提高扩增未知片段的机率。该方法假阳性低、效率高，理论上能扩出所有目的片段。
