高密度光纤芯片技术及其在功能基因组学中的应用

DNA微阵列技术的发展[1]带来了基因表达研究方法上的一场革命。传统的Northern blots或RT-PCR方法只能逐一地研究单个基因的表达，而DNA微阵列技术可以同时例行检测成千上万个基因表达水平的变化，在微芯片上置入寡核苷酸探针或相应于mRNA序列的cDNA，与细胞cDNA或cRNA进行杂交，可以纵观细胞的整体基因表达而不是从前的一个局部。例如，毒理学家可以利用基因表达微阵列芯片快速地对潜在的有毒化合物进行全面评估，仅单个毒理基因组实验产生的大量数据就可以让研究人员从新的高度评估毒物的毒理机制。基于微阵列芯片的肿瘤分类、治疗和预后研究正在发展之中，非常有希望与传统组织学和临床诊断相结合来区分肿瘤类型。这类研究对预测治疗反应也至关重要，可以为患者提供更准确的诊断方法和更好的治疗方案[2]。

和所有的现存技术一样， DNA微阵列技术也有其自身的局限性。技术上的挑战至少有两点。首先，当前的DNA微阵列芯片不适于mRNA剪切变化的探测，人类基因组计划的一个重要发现是人体中表达的蛋白质总数远远超过基因的总数。选择性基因剪切，一种转录后的剪切和拼接机制，使得有限基因上生成的蛋白质具有较大变化。人类基因研究已经揭示近60％的基因具有选择性剪切引起的多种mRNA异构体[3]。在已知的几个特例中，单个基因甚至可以产生成百上千种异构体。果蝇 Dscam 基因估计能够产生约38000种mRNA异构体，该数目大约是整个果蝇基因组中基因总数的两倍。此外，研究中经常发现异构体可以产生功能上相互拮抗的蛋白质，因此非常有必要对不同的mRNA和蛋白质异构体进行研究。虽然当前的DNA微阵列芯片可以用于整个基因组的检测，但是其检测能力很难胜任分辨mRNA异构体的要求。cDNA阵列芯片根本无法测定mRNA剪接变化。与cDNA阵列芯片相比，基于寡核苷酸探针的阵列芯片在分辨能力上有所提高；但是探针与相似序列间的交叉杂交可能降低探测的灵敏度、确切性和定量化。此外，传统微阵列芯片的样品制备和扩增偏向3’UTR，可能错过某些异构体，也可能使探测到的mRNA异构体的比率失真。对DNA微阵列技术的另一个挑战是如何将如此大规模的基因表达研究推向临床应用，这就需要开发一种在临床环境中能够大规模并行筛选病人样本的技术平台，采用常规微阵列技术很难实现这一目的。

光纤芯片技术使上述研究成为可能，该技术采用随机分布的自装配小珠阵列，为复杂生物样本的并行分析提供了一个新颖的通用技术平台 [4,5]。大批直径为3um的小珠被随机装配到模板化的成像光纤束上，单根光纤束含有约50000根光纤，因此可以装配约50000个小珠（图1），阵列中每个位置上小珠的类型通过解码进行辨识，每个小珠上附着的寡核苷酸探针与样品中带有荧光标记的互补序列进行特定杂交以产生探测信号（图2）。

为了同时自动检测多个样本，小型化光纤束被进一步装配成 96或384根的多重阵列形式，与滴度孔板相匹配（图3），由于每根光纤束可以探测成百上千个目标，一个96或384根光纤束组成的多重阵列可以快速有效地检测大量试样，这种阵列形式非常适用于临床条件下对患者样本进行直接化验。

首次使用光纤芯片进行选择性基因剪切研究的结果发表在 Nature Biotechnology上[6]。此项研究结合了光纤芯片技术与一种独特的RNA检测技术(RASL，RNA-mediated annealing, selection and ligation)。实验中，RNA样本与许多对DNA探针混合，每一对DNA探针都可能横跨一个假定的RNA剪接点如果RNA样本中含有特定剪接的mRNA，相应的DNA探针对就会与该mRNA进行杂交并通过连接酶将两个DNA探针相连，连结后的DNA产物经扩增和荧光标记后，与芯片小珠上的互补DNA进行杂交并产生探测信号。这种方法虽然只能鉴别已知基因序列的剪接，但是与采用传统微阵列技术检测选择性基因剪切变化相比已经前进了一大步。

光纤芯片在检测 DNA序列微小变化方面的能力使其成为人类单核苷酸多态性(SNPs，人类基因中最常见的变异类型)研究的有力工具[7]。对人类基因进行SNPs分析可以提供打开人类基因变异大门的钥匙，是一个非常有争议但又有意义的研究课题。理解个体间的基因差异可以预测疾病风险和药物反应，从而提高医学治疗水平。为了实现这些目标，包括中国在内的许多国家间的国际合作努力已经在大规模药物基因组学和人类遗传学研究等领域展开，这些研究要求对数亿计的特定基因和SNPs进行基因型鉴定国际HapMap计划就是其中的一个合作研究项目(http：／／( www.genome.gov/page cfm?Page ID=10001688)这个为期3年投入1亿美元的计划是美国麻省理工学院Whitehead研究所、位于美国San Diego的Illumina公司（光纤芯片技术的主要开发者）、Baylor医学院、加拿大Quebec基因组机构、日本东京大学、中国科学院北京基因组研究所和英国Wellcome Trust Sanger研究所间的国际合作研究。然而，大规模SNPs研究的一个主要障碍是现有技术的低效率和高成本。光纤芯片技术将高度并行样本处理、可扩展自动控制与小型化实验平台结合在一起，为解决这一问题提供了很好的方案[8]。该系统采用高密度微阵列（小珠阵列）技术，结合高通量、高效率的样品制备与扩增方法在整体集成环境中实现了高度并行处理，并通过灵巧地使用实验试剂和自动控制来进一步降低基因分型的成本。

光纤芯片技术正不断地在实践中得到应用。通过将高度并行的特定灵敏试样与小型化阵列平台结合在一起，该技术为人类遗传疾病研究、药物基因组学应用、大规模细胞水平的药靶验证、药物开发和分子诊断学研究提供了强有力而又低成本的工具。

致谢 感谢袁钧瑛教授对本文的编辑整理

参考文献

1. Holloway, A. J., van Laar, R. K., Tothill, R. W. et al., Options available __ from start to finish __ for obtaining data from DNA microarrays _, Nat. Genet., 2002, 32(Suppl.): 481_489.

2. Golub, T. R., Slonim, D. K., Tamayo, P. et al., Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring, Science, 1999, 286(5439): 531_537.

3. International Human Genome Sequencing Consortium, Initial sequencing and analysis of the human genome, Nature, 2001,

409(6822): 860_921.

4. Michael, K. L., Taylor, L. C., Schultz, S. L. et al., Randomly ordered addressable high-density optical sensor arrays, Anal. Chem., 1998, 70(7): 1242_1248.

5. Walt, D. R., Techview: molecular biology, Bead-based fiber-optic arrays, Science, 2000, 287(5452): 451_452.

6. Oliphant, A., Barker, D. L., Stuelpnagel, J. R. et al., BeadArray technology: enabling an accurate, cost-effective approach to high-throughput genotyping, Biotechniques, 2002(Suppl.): 56_61.

7. Yeakley, J. M., Fan, J. B., Doucet, D. et al., Profiling alternative splicing on fiber-optic arrays, Nat. Biotechnol., 2002, 20(4): 353_358.

8. Wang, D. G., Fan, J. B., Siao, C. J. et al., Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome, Science, 1998, 280(5366): 1077_1082.