采用1mm内径柱的UHPLC系统进行分离
现代UHPLC系统用于做简单的分离时，完全可以使用1 mm内径的色谱柱。那么其分离效果如何?怎样才能做到节约溶剂呢?本文会告诉你答案。
液相色谱技术的最大的创新源于2004年引进的超高效液相色谱(UHPLC)技术，首次实现了利用高压及小颗粒柱材料进行色谱分离，使得快速，高效和灵敏的分离得以成为现实。对体系所有相关容积的最小量化，使得UHPLC成为内径2.1mm和亚微米颗粒材料分离柱的理想系统。
此外，为减小在分离柱以外产生的峰展宽，近十年来，设备制造商一直致力于开发完善的UHPLC系统。其中包括对检测池的优化和对内径≤100μm的不锈钢毛细管的研发。在使用溶剂梯度进行简单分离时可以使用1mm内径的色谱柱进行操作，可节省溶剂和改进质谱的兼容性。
图1.如何在现代的UHPLC系统中(图中为Shimadzu的Nexera X2)节省溶剂。
实验部分
液相色谱为岛津公司的Nexera UHPLC系统。其模块化系统包括两个LC-30 AD泵，一个SIL-30 AC自动进样器，一个CTO- 30 AC柱恒温炉，一个SPD- M30A二极管阵列检测器和一个CBM- 20A系统控制器。系统控制和数据处理使用的是LabSolutions软件版本5.57 。实验中采用了两根不同内径的安捷伦ZORBAX StableBond C18分离柱( 2.1 × 50mm，1.8μm和50 ×1mm，1.8μm)(由安捷伦科技公司的Bernd-Walter Hoffmann博士和Edgar Nägele博士友情提供)。试验混合物使用的是Sigma-Aldrich公司经过认证的标准样品( 47651 -U )，它由13种醛和酮-2,4 - 二硝基苯腙组成( 2,4 - DNPH)。该混合物的各成分列在表1中。
表1.测试混合物和它们的洗脱的组分的概述
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分析 |
洗脱 |
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甲醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
1 |
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乙醛-2 ,4-二硝基苯肼 |
2 |
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丙烯醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
3 |
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丙酮-2,4 - 二硝基苯肼 |
4 |
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丙醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
5 |
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巴豆醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
6 |
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甲基丙烯醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
7 |
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2 - 丁酮 |
8 |
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丁醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
9 |
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苯甲醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
10 |
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戊醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
11 |
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M-甲基苯甲醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
12 |
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六角醛-2,4 - 二硝基苯肼 |
13 |
标准样品在注射前用水/丙酮60 /40(v/v)的混合溶剂稀释了10倍。方法开发使用的是Drylab软件(Molnár 应用色谱研究所)并考虑了有机溶剂在流动相中的含量和温度的因素。
结果和讨论
图2 .分离13种醛和酮-2,4 - 二硝基苯腙。
实验第一步是在一根2.1mm内径的分离柱上，借助Drylab软件开发醛和酮-2，4-二硝基苯腙的分离方法(图2a)。标有星号的峰源于标准中的杂质，故在方法中不予考虑。分析物在3.5min内得以分离，其7/8号峰之间的临界分辨率为1.41。由于使用了1.2ml/min的高流速和1.8μm颗粒填充的柱子在进行溶剂梯度时最大压力达到1080Pa。为将图2a中所示的方法无损失地移置到一根1mm内径的分离柱上，就必须进一步减小UHPLC的系统体积。为此，Shimadzu
SIL-
30自动进样器的配置由直接注射改为了“固定样品环”注射。这是就可减少样品带流过的通道及梯度滞后体积。基于研究中使用的分离柱仅区别于内径，移置分离方法就只要求将流速由1.2ml/min降到0.272ml/min
。梯度分布不变。方法移置到1mm内径分离柱上所得的第一批结果见图2b所示。分离在预期的3.5min之内完成且实行溶剂梯度的最大压力为825Pa。分离性能的损失显而易见的，这在杂质引起的带星号的峰上可以看得出来。当使用2.1mm内径柱时(图2a)，杂质与主成分可被分开。相比之下它们在1mm内径柱上仅呈现为峰肩(图2b
)。分离效率的降低也通过比较临界分辨率体现出来。7/8号峰之间的临界分辨率从2.1mm内径柱时的1.41减小至1
mm内径柱时的1.01。可以推测，峰形增宽是由于分离柱扩散体积的增大造成的
提高分离效率
大体积高灵敏度的二极管阵列检测器的检测池(池体积9μl)，将会在接下来的步骤中被1μl的检测池所取代，并重复测量过程。得到的色谱图显示在图2c。通过分离柱后扩散体积的减少来改善分离性能。分析物从分离柱上洗脱为窄峰，从而增加了临界分辨率。7/8号峰的临界分辨率由1.01增至 1.43。另外，标有星号的标准污染物再次从主组分中被分离开来。不过，降低检测池的体积会导致检测灵敏度的降低。使用1μl的检测池相比于9μl的检测池，其分析物的测定峰面积约减小9 ~10倍。
然而，采用1mm的色谱柱的UHPLC在溶剂消耗上很有优势。表2是1000次分析所消耗的有机溶剂量与柱内径之间关系的比较数据，结论是：使用1mm内径柱注射1000次 样品所用的溶剂和废液处理费用可以减少4.5倍左右。
表2.溶剂成本的比较
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方法 |
消耗丙酮 （ml） |
丙酮价格/L （欧元） |
1000此样品分析的丙酮成本（欧元） |
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2.1mm内径色谱柱 |
2.33 |
39,70 |
92.50 |
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1.0mm内径色谱柱 |
0.51 |
20.25 |
优化的质谱联用
使用1mm内径色谱柱的另一个优点体现在与电喷雾电离质谱的偶联上(ESI-MS)。为了达到最佳电离，在LC / ESI-MS系统中流动相的流速通常采用250μl/min或500μl/min。如果使用2.1mm内径柱，流速会高出3~5倍(参见图2a)，从而影响检测限和定量限。相比之下，使用1mm的色谱柱时流速处于LC / ESI-MS偶联的最佳范围。
色块
带1mm色谱柱的 UHPLC
现代UHPLC系统用于简单的分离和溶剂梯度时，使用1 mm内径色谱柱，可以显著节省溶剂和降低废液处理成本。此外，使用1mm的色谱柱的流速最适合于电喷雾电离质谱的耦合。本研究中对系统柱前、柱后分散体积的最小化问题也已进行过优化。
