胶体金免疫层析法快速检测腹泻性贝毒软海绵酸的研究 1

摘　要:腹泻性贝毒是一类分布较广的赤潮毒素,严重威胁到人类的健康和安全。本文用胶体金标记利用细胞融合技术制备的抗软海绵酸单克隆抗体,使用卵清蛋白合成高偶联比的包被抗原,以硝酸纤维素膜为载体,利用免疫层析技术原理,建立了快速检测软海绵酸的免疫层析试纸条方法。方法检出限12 ng/ mL (0. 96 纳克/ 条) 。

关键词:软海绵酸;单克隆抗体;免疫层析;胶体金

中图分类号:O658. 1+ 1 　　文献标识码:A 　　文章编号:100626144(2010) 0120031204

近年有毒赤潮频发,对我国海洋生态和渔业资源造成了巨大损害,赤潮毒素对海水养殖业及人体健康构成了严重威胁。腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning ,DSP) 是由有毒赤潮藻类鳍藻属( Di2nop hysis) 和原甲藻属( Prorocent rum) 产生的一类脂溶性多环醚类天然化合物,主要成分是软海绵酸(Okadaic Acid ,OA) 及其衍生物,能引起食用者腹泻、恶心等。腹泻性贝毒能激发磷酸化来控制大肠细胞内钠的分泌,是蛋白磷酸酶PP1A 和PP2A 的强烈抑制剂,也是一种很强的促癌剂,能引起消化道肿瘤的发生[ 1 ] 。我国海产品特别是贝类受腹泻性贝毒沾污越来越严重[223 ] 。目前,腹泻性贝毒的分析方法主要有小鼠生物法、高效液相色谱法以及一些免疫化学方法。小鼠生物法简便易行,适合于大规模、批量样品的检测,但不能区别毒素的种类和结构,干扰大、不精确。高效液相色谱法( HPLC) ,特别是液2质联用技术,可准确分析毒素的含量和种类,检出限可低至ng/ g ,但样品前处理繁琐费时,且仪器昂贵[ 4 ] 。

因此,建立快速、灵敏的赤潮毒素检测方法,有利于开展大规模水产养殖区和生物样品监测计划,对推动贝类毒素研究和保障人体健康十分重要。

免疫化学方法是基于抗体对抗原的特异性结合的一种分析方法,具有灵敏度高,特异性强,器设备简单,方法易掌握,样品前处理相对简单等优点,适于现场监测和大量样本快速筛查,因而,近年在分析化学领域受到极大的重视且发展迅速[526 ] 。现已有售德国、日本等公司生产的EL ISA 检测DSP 的试剂盒。

国内已有关于OA 抗体制备和EL ISA 检测方法的报道[729 ] ,有关腹泻性贝毒胶体金检测方法的研究也有报道[ 10 ] 。国内尚未见应用免疫层析技术用于分析DSP 的报道。本文用胶体金标记抗体,通过竞争免疫反应,研制快速检测OA 的免疫层析试纸条技术,为我国腹泻性贝毒监测提供快速分析方法。

1 　实验部分

1. 1 　主要仪器、试剂与材料

BIODOT 切割机,XYZ23000 喷点仪购自Biodot公司;JASCO V2550 紫外/ 可见分光光度计;恒温干燥箱、真空干燥箱、切刀、玻璃器皿、试纸条模具均为国产。

胶体金检测用样本垫(玻璃纤维素膜,10 ×300 mm) 、胶金垫(玻璃纤维素膜,8 ×300 mm) 吸水纸(14×300 mm) 均购自Millipore 公司;硝酸纤维素膜(NC 膜,25 ×300 mm) 购自Sartorius 公司。40 nm 胶体金,用1 %柠檬酸三钠水溶液烧制还原0. 01 %氯金酸水溶液,批量制备紫红色的胶体金溶液,最大吸收波长538 nm ,其它试剂均为分析纯。

1. 3 　实验方法

1. 3. 1 　抗软海绵酸单克隆抗体及包被抗原的制备　本室自制OA2OVA 偶联抗原(4. 65 mg/ mL) 和抗OA2KL H 单克隆抗体腹水,制备方法和性质鉴定见参考文献[9 ] 。

1. 3. 2 　单克隆抗体腹水的纯化　用辛酸硫酸胺方法纯化得到粗抗体,再用0. 01 mmol/ L 的磷酸盐缓冲液( PBS ,p H = 7. 4) 透析4～5 d。用分光光度计测得抗体蛋白浓度为1. 78 mg/ mL 。

1. 3. 3 　包被抗原浓度筛选　OA2OVA 偶联抗原用PBS 稀释,稀释倍数分别为原液、稀释2 倍、稀释4 倍,稀释后点在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 备用。

抗原喷NC 膜:抗原用PBS 稀释4 倍后用XYZ23000 喷点仪喷NC 膜,喷量为:0. 74 μL/ cm , Y = 16cm ,37 ℃干燥过夜,备用。

1. 3. 4 　金标抗体的制备　抗体标记量为20μg/ mL 。先取20 mL 40 nm 的胶体金于干净的烧杯中,用1 mmol/ L的NaOH调节其p H 值为8. 2 ,加入抗体,使其在胶体金中浓度为20μg/ mL ,搅拌1 h ,加入胶体金1/ 10 体积的10 %牛血清白蛋白溶液,搅拌30 min ,5 000 r/ min 离心30 min ,取沉淀,用PBS 复溶,约加入4 mL 缓冲液,用紫外分光光度计扫描胶体金特征吸收峰,确定胶体金OD 值后用PBS 缓冲液稀释,使其OD 值为5 ,分成100μL/ 管,插入点好各种抗原浓度的NC 膜,观察NC 膜显色情况,确定用稀释4 倍的抗原筛选抗体标记浓度。

抗体标记量的选择:按照金标抗体的制备方法,标记不同浓度的抗体量,分别为20 、15 、10 、5μg/ mL ,配制适当浓度,使其OD 值为5 ,用XYZ23000 喷点仪将金标抗体喷在胶金垫上,喷金量分别为10 、8 、6 、4μL/ cm ,真空干燥2 h ,备用,抗体共计16 个梯度条件。