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如何关闭CRISPR基因组编辑系统中的Cas9

2017.6.07

   CRISPR/Cas9技术正在如火如荼地发展。形形色色的Cas9变体被开发出,用于基因组编辑,激活和抑制基因表达,以及其他。不过,似乎还少了些什么,Cas9的活性一旦开启就无法关闭。人们担心,Cas9在细胞内停留的时间越长,脱靶编辑的可能性也越大。因此,Cas9不仅需要“开”,也需要“关”。

  幸运的是,多伦多大学和马萨诸塞大学的研究人员的确发现了这种开关。这些anti-CRISPRs是来源于噬菌体的蛋白抑制剂,可帮助噬菌体逃避细菌的CRISPR/Cas免疫系统。它们最初是在I型CRISPR/Cas系统中发现的,但基因组编辑主要依赖II型CRISPR/Cas系统,因此对研究人员来说不是很有用。

  2016年底,多伦多大学的April Pawluk等人在《Cell》杂志上报告称,他们在脑膜炎奈瑟氏菌(Nme)中发现了II型系统的三种anti-CRISPRs。尽管化脓性链球菌的Cas9(SpyCas9)是最常用的CRISPR系统,但脑膜炎奈瑟氏菌也可用于基因组编辑。

  anti-CRISPRs抑制Cas9的活性

  当这三种anti-CRISPRs在脑膜炎奈瑟氏菌中表达时,它们抑制了NmeCas9的活性。在HEK293细胞中表达时,它们也能抑制NmeCas9。对于这些实验,研究人员用三种质粒转染细胞,这些质粒分别表达:1) NmeCas9,2) sgRNA和3) anti-CRISPR(Acr)。通过T7核酸内切酶1(T7E1)分析,研究人员发现,Acr的表达使编辑从30%降低到0-10%。

  anti-CRISPRs阻止dCas9结合

  除了作为基因组编辑的“关闭开关”,一种anti-CRISPRs(AcrIIC3Nme)也阻止了NmeCas9与DNA的结合。为了验证这一点,研究人员在U2OS细胞中表达GFP标记的dNmeCas9与mCherry标记的dSpyCas9。当anti-CRISPR不存在时,dNmeCas9(绿色)和dSpyCas9(红色)共同出现,表现为黄色。之后,anti-CRISPR的表达便消除了绿色位点,说明它对dNmeCas9结合DNA的强力抑制。

  anti-CRISPRs的出现让Cas9基因组编辑工具箱又多了一种工具。研究人员已经证明了它们能够抑制细菌和哺乳动物细胞中的Cas9基因组编辑,并且能够抑制dCas9与DNA的结合。现在,这些质粒已经在Addgene网站上提供。也许,它们也能为您助上一臂之力。

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