电子显微镜使用实验_透射电子显微镜的样品制备
| 实验方法原理 | 一、电子显微镜的分辨力和放大率 电子显微镜是利用电子流代替光学显微镜的光束使物体放大成像而由此得名的。发射电子流的电子源部分称为电子枪，电子枪由发射电子的“V”形钨丝及阳极板组成，在高真空中，钨丝被加热到白炽程度，其尖端便发射出电子，发射出来的电子受到阳极很高的正电压的吸引，使电子得到很大的加速度而到达样品。电压越高，电子流速度越快，波长越短，其分辨能力也越强。一般用50-100 kV电压时，电子波长在0.54-0.37 nm，所以电子显微镜的分辨力极高，可达0.2 nm左右，此分辨力比光学显微镜提高了近1 000倍。 在电子流的通路上不能有游离的气体分子存在，否则由于气体分子与电子的碰撞而造成电子的偏转，导致物像散乱不清。因此，电子显微镜除需要高电压外，还需要高真空的装置。 电子显微镜的放大率是由透镜决定的，在电子显微镜中，透镜是由看不见的电磁场构成的，称为电磁透镜，简称磁透镜。由电子枪发射出的电子流可以通过磁透镜的磁场吸引发生偏折而放大物体，这与光学显微镜的光线通过玻璃透镜发生折射而放大物体的情况一样，但它不同于光学显微镜的是可利用多个磁透镜的组合而得到逐级放大的电子像，所以现代电子显微镜的成像系统由多个电磁透镜组成。而光学显微镜由于玻璃透镜本身存在有相差的缺陷，其放大率不能通过增加透镜的数目来无止境地提高。 此外，通过改变这些电磁透镜的磁场强度也可提高放大率。磁场越强，焦距越短，放大倍数也就越大。所以现代电子显微镜的成像物镜大多数采用短焦距的强磁透镜，放大倍数可达一百万倍以上。 二、电子显微镜的成像原理 任何一个物体都是由原子组成的，原子则是由原子核与轨道电子组成的。当电子束照射到样品上的时候，一部分电子能从原子与原子之间的空隙中穿透过去，其余的电子有一部分会与原子核或原子的轨道电子发生碰撞被散射开来；一部分电子从样品表面被反射出来；还有一些电子是被样品吸收以后，样品激化而又从样品本身反射出来等。如果把所有这些不同类型的电子收集起来，使它们成像，便可以构成不同类型的电子显微镜。这里只着重介绍透射电子显微镜和扫描电子显微镜。 1. 透射电子显微镜 透射电子显微镜收集的是透过样品的电子。在透射电子显微镜中，物像的形成主要来自电子的散射作用与干涉作用。散射作用分“弹性散射”和“非弹性散射”两种。弹性散射指电子和原子核发生碰撞，电子基本上不损失能量，而只是改变运动方向，这种碰撞称为弹性碰撞，这时候我们说电子发生了“弹性散射”作用。如果电子是和轨道电子发生碰撞，电子不仅会改变原来运动的方向，而且还会损失一部分能量，这时电子便发生了“非弹性散射”作用。 由于物体上不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密的差别，在散射电子能力强的地方，透过去的电子数目少，因而打在荧光屏上所发出的光就弱，显现为暗区；而散射电子能力弱的地方，透过的电子数目多，打在荧光屏上所发出的光就强，显现为亮区，这样，便在终像上造成了有亮有暗的区域，因而出现了反差，人眼就可以辨别。散射作用形成的反差造成强度上的变化，因此又称为“振幅反差”。由于在电子显微镜中利用的是人眼看不见的电子流，所以通常用一块荧光屏来把电子流转换成可见的荧光，使人眼可以接受。 除了散射作用能引起反差外，电子的干涉作用也能造成反差，在电子发生非弹性碰撞的时候，由于电子会失去一部分能量，因而使它前进的速度变慢，这部分速度减慢的电子会和速度不变的电子发生干涉作用，结果造成电子相位上的变化，从而也引起反差，称为“相位反差”。 在低倍观察时，振幅反差是主要的反差来源，而在高倍观察时，也就是在辨别极小的（如1 nm大小）细微结构时，相位反差则起主要作用。 2. 扫描电子显微镜 与透射电子显微镜不同，扫描电子显微镜是把从样品表面反射出来的电子收集起来并使它们成像，所以又称反射电子显微镜。扫描电子显微镜的成像原理与电视或电传真照片的原理相似，由电子枪产生的电子束经过三个磁透镜的作用，形成一个很细的电子束，称为电子探针。电子探针经过透镜聚焦到样品表面上，按着顺序逐行逐行地通过样品，也就是对样品扫描，然后把从样品表面发射出来的各种电子（二次电子、反射电子等）用探测器收集起来，并转变为电流信号经放大后再送到显像管转变成图像。 扫描电子显微镜主要用来观察样品的表面结构，分辨力可达10 nm，放大范围很广，可从20倍到几十万倍。透射电子显微镜的分辨力虽然很高，但是一般只能观察切成薄片后的二维图像，扫描电子显微镜能够直接观察样品表面的立体结构，并且具有明显的真实感。许多电子无法透过的较厚样品，只能用扫描电子显微镜才能看到。
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、金属网的处理
图2 用电镜检测质粒DNA的方法示意图 核酸分子链一般较长，采用普通的滴液或喷雾法易使其结构受到破坏，因此目前多采用蛋白质单分子膜技术来进行核酸分子样品的制备。其原理是：很多球状蛋白均能在水溶液或盐溶液的表面形成不溶的变性薄膜，在适当的条件下这一薄膜可以成为单分子层，由伸展的肽链构成为一个分子网，当核酸分子与该蛋白质单分子膜作用时，会由于蛋白质的氨基酸碱性侧链基团的作用，使得核酸从三维空间结构的溶液构型吸附于肽链网而转化为二维空间的构型，并从形态到结构均能保持一定程度的完整性。最后将吸附核 酸分子的蛋白质单分子膜转移到载膜上，用负染等方法增加样品的反差后置电镜观察。可用展开法、扩散法、一步稀释法等使核酸吸附到蛋白质单分子膜上，本实验采用展开法。 |
| 注意事项 | 1. 铜网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。 2. 火棉胶膜的制备所用溶液中不能有水分及杂质，否则形成的膜的质量较差。 3. 聚乙烯甲醛膜（formvar膜）的制备所使用的玻片一定要干净，否则膜难以从上面脱落；漂浮膜时，动作要轻，手不能发抖，否则膜将发皱；同时， 操作时应注意防风避尘，环境要干燥，所用溶剂也必需有足够的纯度，否则都将对膜的质量产生不良影响。 4. 在单分子膜形成时整个装置最好用玻璃罩等盖住，以防操作人员的呼吸和旁人走动等引起气流的影响以及灰尘等脏物的污染。另外，在展开溶液中可适量加入一些与核算量相差不悬殊的指示标本，如烟草花叶病病毒等，以利于鉴定单分子膜的展开剂后面转移的好坏。 展开 |
| 其他 | 一、电子显微镜与光学显微镜的主要区别
图1 电子显微镜与光学显微镜的区别 根据电子束作用于样品的方式的不同及成像原理的差异，现代电子显微镜已发展形成了许多种类型。目前最常用的是透射电子显微镜（transmission electron microscope）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope），前者总放大倍数可在1 000~1 000 000倍范围内变化，后者总放大倍数可在20~3 000 000倍之间变化，本实验主要介绍这两种显微镜样品的制备。 展开 |
