组织微阵列的制作
实验概要
本文介绍了组织微阵列(TMAs)的制作原理及基本操作流程。
实验原理
组织微阵列原理是借鉴计算机平行分析的思维 ,对生物信号进行平行分析。利用微点阵技术 ,借助于机械手将成千上万的组织片点阵固定于固相载体上,可进行常规 HE染色 ,也可以与标记的样品进行聚合酶链反应、荧光原位杂交、免疫组织化学等方法 ,平行的检测微阵列中每份标本的 DNA /RNA及蛋白质等表达 ,采用同一块微阵列能够完成大量的生物标本分析与形态学;基因型和表型特征相关性分析 ,进而获得样品分子数量和序列信息。技术原理：首先根据苏木精；伊红(HE)染色结果确定肿瘤的大小、类型、分级， 再确定预计取样组织的位置，然后用专用穿刺细钢针进行穿刺，将此柱状物固定于膜具上。 每个标本间隔0.1mm，以0.4um 的厚度进行切片，将薄切片黏附于尼龙膜或载玻片等固体载体上，就制成了 TMAs随着技术的进展，每个标本的直径由最初的大于3mm缩小到0.6mm，使得在一个蜡块上可以取样 1000次以上。制成的 TMAs 可应用免疫组化、原位杂交的方法进行研究。TMAs技术也可应用于对细胞系的检测。将所需检测的细胞离心于Eppedorf管中，用甲醛等固定后用穿刺针取样，即可用于制作TMAs。
实验步骤
制作主要类型分为: 1.大规模cDNA微阵列；2.芯片外寡核苷酸合成；3.原位合成寡核苷酸制造芯片；4. 应用喷墨打印机技术制造芯片。
其制作过程为：
1. 将收集的病例组织固定，制作成供体蜡块(Donor)切片、HE染色进行病理诊断和病变组织定位。
2. 根据所设计组织微阵列大小的需要在空白受体石蜡模块 ( Recipient)上打孔。
3. 在定位好的供体蜡块上打孔，钻取所需组织芯 (Tissue Core) 转移到受体石蜡块上。
4. 受体石蜡切片，制作成组织微阵列切片(TMAs)用于相关的原位研究。
制备具体流程如下:
1. 首先在组织蜡块库中进行组织筛选和定位选择组织块(如制作胃癌微阵列 ,取胃癌的组织块)，对目的蜡块切面特定区域做标记。
2. 根据标记供体蜡块部位用供体针 (包括两个穿刺针:大针和小针 ),大针可对供体组织蜡块精确地采样 ,小针用于对受体蜡块精确的打孔 ,其孔径与采样针内径相同 ,这样大针采样品可以刚好打入受体蜡块相应孔中 ,利用常规切片作参照,从蜡块相应典型部位取组织芯 ,其直径约 016～110 mm。
3. 将供体组织芯放入受体空白蜡模 ,每份标本在标记区域内取2条组织芯,统一而准确记录每个样本在二维阵列中的具体位置;重复上述操作,可制备出孔径、孔距、孔深完全相同的阵列蜡块。
4. 将阵列蜡块放到52℃±0.15℃ 烤箱内烘烤2～3h,使蜡模既不熔化,又不产生气泡和裂痕,关键是使供体组织条与受体蜡模完全融合且不移位 ,保护微阵列组织的平面性和完整性。
5. 切片前置于20℃冰箱中冷冻30 min,使组织蜡块硬度和脆性达到一个良好契合点,该蜡块可以连续3μm厚切片,可以切完成TMA组织片约200张。切片刀要锋利,以保证每一块组织芯均能被完整切下。使用蒸馏水裱片,避免水中含有任何杂质,水温控制在38～40℃。捞片时速度应快 ,防止组织的漂移。敷贴在玻片等固相载体上,便可用于免疫组化或分子杂交等检测。
6. 制作好的片子放烘箱中，烤好以后的片子放入专用盒 ,4℃冰箱保存。
