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流式荧光-液芯技术的原理及其应用

2019.6.24

曾经在2000年前后经历过辉煌发展的传统生物芯片，经过10年左右的应用，科学家们终于有了些更客观和更清醒的认识，同时产业界也衍生出了更专业更具特点的新型生物芯片。传统基于玻璃片、硅片、膜片的所谓“固态芯片”是生命科学研究领域中非常优秀的科研工具，它们的共同特点是在固态基材上极小的面积里合成或固定上许多核酸或蛋白探针，芯片上的每个或几个点代表一个基因或蛋白。利用生物芯片，科学家们可以通过一个实验对成千上万的基因或蛋白指标进行分析。但遗憾的是，这些芯片的致命弱点就是其信息质量的稳定性和可重复性比较差，操作也较繁琐。正因为如此，芯片的临床应用受到了很大的限制。与固态芯片“数据量多，数据质量差”的特点相对，美国Luminex公司开发的流式荧光-液芯系统，以“高通量，高质量，全定量，3维杂交，灵活组合”等特点，成为正在崛起的一种临床应用型的高通量代表性技术。

流式荧光-液芯的概况

美国Luminex 公司开发出的流式荧光-液芯技术平台是一种全新概念的生物芯片。该技术的核心是把微小的聚苯乙烯微球（5.6um）用荧光染色的方法进行编码，目前共有100种编码。每种荧光编码微球分别共价交联不同的基因探针或抗体抗原。应用时，把针对不同检测物的荧光编码微球混合后再加入微量病人标本，在悬液中靶分子与微球进行特异性地结合；最后Luminex流式点阵仪的两束激光对微球进行逐颗分析，并得出每种标志物的信号和浓度。相比固态芯片的反应动力学，液芯技术中的捕获分子和被捕获分子都在运动，故碰撞几率很高，反应速度很快，可以视作三维的反应动力学。该高通量的技术从产品本身外观上看，没有传统固态芯片那种有型的玻片或膜片基材，其含微球的溶液肉眼观是澄清透明的，所以又有“液态芯片"之称。

液态芯片技术平台应用非常广泛，编码微球上可以包被蛋白也可以连接核酸，所以液态芯片既可以用来检测蛋白（蛋白芯片），也可以检测核酸变化（基因芯片）。早在1997年，《临床化学》杂志就刊登专文介绍多功能Luminex流式点阵仪及其技术，并将其誉为“真正的临床应用型生物芯片”。随后，运用Luminex流式点阵仪及其技术进行临床诊断和基础研究成为生命科学研究领域的一大热点，相关的研究论文频频刊登在《临床化学》、《临床与诊断免疫学》、《临床微生物》、《基因组研究》、《蛋白质组研究》、《癌症》等国际权威学术杂志上。2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列流式点阵试剂率先通过美国FDA的严格认证，标志着多功能流式点阵仪及其技术得到了美国官方的认可，并由此成为首个，也是目前唯一得到美国FDA许可用于临床诊断的多指标并行检测技术。2005年6月9日，基于液态芯片技术的学术论文刊登在当日出版的《自然》杂志上，这是学术界认可一项技术所能给予的最高荣誉。2005 年11 月，为了表彰其对临床诊断技术进步做出的革命性贡献，全球科技产业和行业研究的权威机构――Frost & Sullivan―授予xMAP技术“2005年度国际临床诊断技术革新大奖”，标志着液态芯片技术在国际临床诊断技术领域的领军地位得到了最具权威的认可。

流式荧光-液芯技术的比较优势

高效：因为许多编码的聚苯乙烯微球可以放在同一个反应体系内，所以一次可同时检测多种（100种）生理病理指标。这与传统逐个检测的方式效率有很大的不同。

高敏感：每个聚苯乙烯微球上都以共价结合的方式包被上许多抗原、抗体或核酸分子，因其参与反应的分子多，产生的信号就强。另外信号阅读时用的是激光激发荧光的方法，这种方法也是发光的方法之一，其灵敏度明显比酶学显色的方法高，与各种化学发光的方法类似。据Qiagen公司的报道，用该平台检测IL－8时，其灵敏度为0.01pg，达到了非常惊人的水平。

快速：因为杂交或免疫反应在悬浮的液相中进行，所以反应时间短，杂交后常不用清洗就可以直接读数，所以检测效率大大高于固相杂交。所用时间从几小时缩短到十几分钟。

重复性好：固相芯片不能很好地应用于临床诊断，其中一个重要的原因是其重复性差，这是固相芯片目前难以克服的技术障碍。但流式荧光液芯技术其分子反应发生在均相的液体环境中，其结果稳定，重复性非常好，在一个反应体系中针对每个指标有1000－5000颗相同的微球，即相同的反应单元；检测时，抽取其中的100－500颗读数，最终的数据是取其均值，这样已经把误差减到最小，而固相芯片每个指标只有1－2个数据，其数据的可靠性相对较差。

液态芯片技术在生命科学中的应用

在液态芯片平台上可以开发许多产品，根据目标检测物的不同，可大致分成两大类，一类是蛋白芯片，另一类是基因芯片。蛋白芯片基于的原理是抗原抗体的特异性相互作用，它所检测的目标物是蛋白；基因芯片是基于核酸分子杂交理论来设计的，它所检测的目标物是核酸。

国外目前有60余家公司正在研究基于液态芯片技术的产品。有的是主要应用于生命科学研究和药物研究的，有的是用来临床诊断，主要涉及的领域有：过敏源筛查，自身免疫病，肿瘤标志物，心血管疾病标志物，细胞因子，内分泌和激素，组织分型，感染性疾病检测，激酶和磷酸化，金属蛋白酶类。

自2001年7月INOVA DIAGNOSTICS公司的ENA四联检通过FDA认证以来，截止2008年底，基于液态芯片技术平台，已有48项检测试剂（超过200种指标）通过FDA的严格认证，进入临床应用。涵盖的领域包括自身抗体谱、呼吸道病毒核酸谱、常见过敏原抗原及抗体谱和囊性纤维病的基因突变谱等方面。

在国内，国家食品药品监督管理局目前已经批准了两大类产品，即肿瘤标志物定量检测试剂和HPV核酸检测试剂。这两类产品都是由上海透景生命科技有限公司研制和生产的。

液芯在肿瘤标志物检测中的应用

肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因变异累积的复杂病变过程。近年来，合理选择几项灵敏度、特异性能互补的肿瘤标志物进行组合检测逐渐成为共识。“液态芯片”出众的高通量检测性能正好契合了临床肿瘤标志物应用的需求。它的基本原理是，在不同荧光编码的微球上共价交联针对不同肿瘤标志物的抗体，把这些带有抗体的微球混合，加入血清后与血清中相应的抗原结合，然后荧光抗体再与抗原结合，最后上机检测，通过两束激光分别检测微球编码和荧光信号，实现对多种肿瘤标志物的联合检测。

流式荧光-液芯技术与化学发光、电化学发光技术一样同属发光类技术之一，具有灵敏度高、重复性好、线性范围广等优点，同时又由于其独特的检测原理，液态芯片具备了其他发光类技术所不具备的高通量检测能力，代表了临床肿瘤标志物检测的应用趋势。2009年3月，在该技术平台上SFDA已经颁发了12项常用肿瘤标志物的医疗器械注册证（包括AFP、CEA、CA125、CA19-9、t-PSA、f-PSA、NSE、CA72-4、SCCA、Cyfra21-1、CA242 和 free-β-hCG）。随着液态芯片肿瘤标志物检测试剂获得市场准入，逐渐进入临床实验室和各大体检机构，其强大的检测能力和高质量的检测数据迅速引起了国内临床检验界的广泛关注。

现有的肿瘤标志物检测方法主要有：酶联免疫法、放射免疫法、发光法、固态（膜基）芯片法。固态芯片（蛋白芯片）也是一种多指标检测技术，由于其捕获与被捕获分子之间的反应特点，准确性和重复性存在一定的缺陷。目前用于肿瘤标志物检测的主流试剂属于化学发光免疫分析与电化学发光免疫分析两大类，前者以美国的雅培（ABBOTT）、贝克曼（BECKMAN），德国的拜耳（BAYER）为代表，后者为瑞士罗氏（ROCHE）的ZL技术。

以下就Luminex流式点阵仪与化学发光/电化学发光仪的主要性能指标作简要对比（见下表）：

性能指标	Luminex流式点阵仪	化学发光/电化学发光仪
1次检测指标数	多指标并行检测，1次最多可测100个指标，灵活，按需组合	单指标检测，1次检测1个指标
是否可以做基因检测	可以，比如HPV	不可以
试剂成本	比发光法低20％－30％以上	成本高
检测速度	最快可达10 000测试/小时	80～150测试/小时
灵敏度、准确性	高
重复性	好，每个指标分析100次取均值	好，每个指标分析1次
技术的先进性	2005年国际诊断技术创新大奖，截止2007年国际上已装机6000台。检验的趋势性技术。	20年前发展起来的，近年来已没有太大进展。
是否能扩展为科研平台	非常优秀的科研平台技术，可以自行设计指标。基因和蛋白都可以研究。	不可扩展性，不可自行设计指标，不可研究基因。

流式荧光-液芯技术在HPV检测上应用

高危型HPV感染与宫颈癌的发生关系密切。文献报道与宫颈癌有关的高危亚型约有20种。目前用于HPV检测的试剂主要是流式荧光杂交法、固态膜杂交方法和杂交捕获方法三大类，固态膜芯片以导流膜杂交、反向膜杂交为代表，杂交捕获法的代表是美国Digene（现为Qiagen）公司的HC2产品。以膜杂交为基础的方法，其设备费用低廉，使用门槛低。各种膜杂交方法通常采用的是膜片杂交、酶联显色、肉眼或扫描观察颜色深浅来判断结果，而流式荧光杂交法的HPV检测，采用的是微球杂交、激光荧光定量检测、数字信号，相比较而言具有多方面的优势。

以下就Luminex流式点阵仪与现阶段流行的HPV检测方法的主要性能指标作简要对比：

性能指标	流式荧光液芯技术	导流杂交	反向杂交	HC-II
是否需要洗涤（反复洗涤带来变异和污染）	否	多次反复洗涤	多次反复洗涤	是
结果判断	激光分析，电脑自动出数字化结果	膜点，肉眼判断颜色深浅	膜点，肉眼判断颜色深浅	显色比例
是否分型	是	是	是	否
重复性	极好	较差	较差	好
检测样本数/次	1-96个	15个	20个	45个
污染可能	低	高	高	低
杂交时间	15分钟	40分钟	2小时或过夜	40分钟