基于微流控芯片的固相萃取技术简介
目前，国内外针对微流控芯片上样品的前处理的方法和技术研究越来越多，最主要的技术有过滤、膜分离、液-液萃取、固相萃取、等速电泳和场放大堆积等。
这些方法各有特色和优势，有的兼具样品提取和富集的功能。
特别是固相萃取技术，其富集倍数甚至可达10^5，超过某些专门的样品富集技术。
与其他前处理方法相比，固相萃取技术更容易与芯片平台相结合，通过选择合适的固定相，该技术可以对不同的目标分析物进行纯化富集，相关的研究也方兴未艾，引起了国内外学者的极大关注。由此可见，固相萃取技术已成为微流控芯片系统中最重要的样品前处理技术之一。
本文将侧重微流控芯片分析系统中固相萃取技术的三种不同模式: 开管柱、填充柱、以及整体柱进行了详细的介绍，比较了各种方法的特点及优缺点。
微流控芯片固相萃取技术的原理
固相萃取技术(solid phase extraction，SPE)是一种基于分析物在固态基质上的吸附和解吸，而实现液态样品的纯化和富集的样品前处理技术。
当试样溶液流过固相基质时，分析物被保留在合适的固定相上，当选择合适的溶液将干扰组分淋洗掉之后，再用少量溶剂迅速洗脱分析物就能实现分析试样的纯化和富集。这种富集效应可用如下公式确定:
F=PVi/VF
其中，F为富集倍数，P为相转移率，Vi和VF分别为样品溶液体积和洗脱液体积。由公式可知，富集倍数与样品进样和洗脱两个过程有着直接的关系。
为了获得理想的样品富集效果，在实验中，往往需要优化样品进样浓度和体积、进样速度和时间以及洗脱液体积等一系列参数。
芯片上的固相萃取指的是固相基质存在于芯片的微通道内，以压力或电动力为驱动力(前者可以由泵产生，也可由液面间的高度差产生;后者一般由高压电源产生) ，由微阀或微泵控制的在线样品处理技术。
与传统的固相萃取技术不同的是，除了采用电渗驱动等特殊方式，该技术还具有微型化和在线处理的特点。目前，芯片上的固相萃取技术已经广泛应用于各种小分子物质的提取和富集，也有很多学者对蛋白质和DNA等大分子的芯片上前处理做出了研究，并取得了良好的进展。
微流控芯片固相萃取技术的分类
芯片上的固相萃取具有传统固相萃取技术不可比拟的优势，把固相萃取柱直接制作到芯片上，不仅能提高系统的集成度，消除接口带来的死体积，还能避免离线处理过程中试样损失和被污染等诸多问题。按照吸附剂存在形式的不同，芯片上的固相萃取可分为三种模式: 即开管柱、填充柱和整体柱。
开管柱
在芯片的通道内涂渍具有高度亲和性的固定相称为开管柱。在开管柱中，固定相仅结合在微通道的内壁，而不充满整个管道。制备时，一般将溶有固定相的溶液注入微通道内，通过键合、交联或物理吸附等方法将其中的固定相结合在微通道内壁，之后再除去多余的溶液，并清洗管道即可得到。
制备开管柱最常用的一种方法是涂渍法，该法是直接将涂渍试剂加入到微通道中，利用形成的涂层作为固相萃取吸附剂。这样制备所得的开管柱不仅具有空心结构、柱压较小，而且制备方法相对简单。进行固相萃取时，目标分析物可以与吸附剂涂层之间发生相互作用而被保留，而干扰物则可以直接流出。
目前，这类开管柱主要应用于小分子化合物的富集，已有不少学者在此方面开展了很多优秀的工作。例如，Kutter等首次将涂渍法用于微流控芯片，随后其又在一个长度为33 mm的玻璃芯片的通道内，涂渍了C18硅烷作为固定相，当8.7 nmol·L-1样品经电驱动方式进样后被吸附在开管柱表面，通过改变缓冲液中乙腈的浓度对样品进行洗脱之后，结果发现目标物香豆精染料C460可在160 s内达到80倍的富集。
此外，也有学者将C18硅烷作为电色谱分离中的固定相进行了一些研究，如Broyles将四种芳香类化合物的混合物作为样品，向其中添加直径为5 μm的微球作为杂质，在玻璃芯片的样品入口处制作了7个平行的微阵列通道( 1 μm deep，18 μm wide)
实验中，运用此装置首先对样品进行过滤式预处理，以除去杂质，之后在涂有C18硅烷的分离通道内( 5 μm deep，25 μm wide)，用含乙腈的缓冲液作为洗脱剂和流动相，在电色谱模式下，以激光诱导荧光( LIF)作为检测器，在50 s内对四种芳香族化合物 (蒽、芘、1，2-苯并芴和苯并芘)完成了过滤分离-在线富集-色谱分离的过程，且过滤通道入口处的微球杂质不会影响芯片上的相关操作。
该实验发现，通过延长芘的富集时间至320 s，其富集倍数可达400倍。
又如东京大学的Kitamori课题组在玻璃芯片微通道内涂渍C18作为固相萃取吸附剂，将整个反应的溶剂混合、萃取、检测功能集中在两块芯片上，对农药西维因进行了检测，芯片的结构示意图如图所示。
两块芯片之间通过一个10 cm长的毛细管相连，在芯片1上，西维因与碱性介质作用后水解成1-萘酚，与芯片2上的三甲基苯胺发生重氮化作用后，再用甲苯将其萃取，进而用激光热透镜( TLM) 检测。结果表明，西维因在3.4×10^-7～3.5×10^-6 mol·L-1范围内呈良好的线性关系，检出限为7×10^-8 mol·L-1。利用此装置，还对克百威和残杀威等农药进行了检测，均能获得满意的结果。
事实上，由于涂浸法所得的固定相涂层的只是涂布在管道内壁，故比表面积小，负载容量低，且随着使用次数的增加，涂渍涂层厚度也会逐渐变得不均匀，从而使得分析稳定性变差。
为了获得性能优异的通道表面以实现对目标分析物的高选择性的分离富集，很多学者开始致力于各种芯片材料的通道表面修饰技术的研究。
例如，作为制作芯片较常用的一种高分子聚合物，聚二甲基硅氧烷( PDMS) 具有良好的化学惰性、光学性质和电绝缘性，且价格低廉，容易加工。但较强的表面疏水性以及较低的电渗流( EOF) 限制了它在某些方面的应用。
所以，对PDMS的表面修饰及改性技术的研究也就应运而生，Lee等利用氧等离子体技术处理PDMS芯片表面，使其表面产生带负电的羟基基团后，再通过静电作用对PDMS芯片的表面进行修饰，非常有效地抑制了生物分子蛋白质在PDMS芯片表面的非特异性吸附，出色的实现了生物大分子的高效回收。还有，Peterson等研究表明，未经处理的PDMS芯片对细胞的生长起阻碍作用，而经氧等离子体处理的PDMS芯片则能支持细胞的生长。
再如，Pruden等利用氨等离子体处理PDMS芯片，并通过控制处理时间、温度以及等离子体的强度，实现了PDMS芯片表面的腈基、氨基和亚胺基功能化，从而可以对带有不同官能团的化合物进行富集。除此之外，国内还有很多课题组对于其他材料的芯片通道表面修饰和改性进行了研究，并取得了满意成果。
然而，在开口管固相萃取模式下，虽然可以通过发展合适的修饰技术，或选择合适的芯片材料，使得吸附容量在一定程度上有所提高，但有限的通道比表面积仍不利于样品的纯化和富集。因此，发展芯片上新型的固相萃取模式是亟待解决的问题。
填充柱
固相萃取填充柱是指通过微加工技术直接在芯片微通道中形成柱塞( 栅栏、坝、堰等) ，硅胶、微珠等颗粒靠压力驱动或电驱动等方式被填入柱体，由柱塞截留在微通道内作为固相萃取吸附剂，即形成填充柱。
柱塞的制备通常是采用原位加工技术，即通过微加工技术直接在微通道的相应位置加工出合适的柱塞。理想的柱塞应具备高强度、小流阻和强化学惰性等特点。更新填充柱时，只需反向冲出填充微粒即可。与开管柱相比，填充柱的比表面积很大，在一定程度上提高了固相萃取的富集效率。
前几年，林炳承课题组就借助于商品化的微孔滤膜和固相萃取填充柱，成功的制作了一个含有三层结构的芯片体系，如图所示，此芯片设计巧妙，由三层结构组成，上层为含有流体通道和充满C18硅烷颗粒的固相萃取填充柱( 2.5 mm long，300 μm wide，95 μm deep)的PDMS层，下层为含有流体通道的PDMS层，两层通道交汇处设置一个聚碳酸酯核孔膜(PCTE) ，由于膜的截留作用，小分子能在电场驱动下透过膜进入下层PDMS通道中，而大分子则被截留在上层原有流体中。
试验中将FITC标记的盐酸麻黄碱和罗丹明B溶液分别进行在线固相萃取之后，经激光诱导荧光检测器检测，富集倍数分别为900和1000左右。该装置性能良好，既可用于复杂体系中小分子物质的选择性进样，也能在电泳分离前对大分子物质进行纯化和富集。
Dahlin等在PDMS芯片上的一段较细的通道(50 μm，o. d. ) 内填充高度交联的聚苯乙烯微珠作为固相萃取吸附剂制的填充柱，所设计的芯片结构将固相萃取、电泳分离和质谱电喷射尖嘴集于一身
如图所示，上层通道( 50 μm，o. d. ) 作为电泳分离通道，下层通道( 80 μm，o. d. ) 通道为进样通道，实验中将六种不同浓度的神经肽溶解在类似于生理环境的盐溶液中，以模拟实际的体液样品，经固相萃取填充柱脱盐，电泳分离和电喷雾离子化后进入质谱，分析检测限高达10^-15 mol·L-1。
除此之外，还有Jemere在玻璃芯片上制备双围堰式填充柱( 200 μm long)，即在固定相两端各设一个围堰，同时还在侧向加工一条通道以供填充颗粒的引入和更新。此围堰的体积为 330 pL，实验中将直径范围为1.5～4μm的微粒引入其中
如图所示，1. 0 nmol·L-1的荧光染料BODIPY在该双围堰式填充柱上的富集时间从80 s增大到523 s后，富集倍数可达500倍，其检测限可达70 fmol·L-1，而未经富集的样品检测限大约在30 pmol·L-1。
进一步的优化结果显示，该装置对荧光染BODIPY的最大富集倍数可达1000倍。
此外，通过对荧光标记亮氨酸( 1 nmol·L-1) 的富集和检测，表明该填充柱也可以用于痕量氨基酸和小分子量多肽化合物的富集。
此外，为了提高样品的吸附容量，提高萃取效率，还有很多学者致力于芯片上集成阵列式SPE柱的研究等。清华大学的林金明课题组采用再曝光技术在芯片上制作出坝结构，将C18微粒固定在微通道内，成功制备了分离纯化能力良好的9阵列填充柱(柱长为10 mm)，结合稳定同位素稀释法，实现了芯片上乳腺癌细胞( MCF-7) 的培养及其代谢物的定性和定量分析检测。
如图所示，培养基和具有抗癌作用的染料木黄酮通过微流网络通道形成的浓度梯度单元后，被引入细胞培养室，诱导所培养的乳腺癌细胞发生凋亡，细胞代谢产物经9阵列柱上脱盐纯化后依次进入电喷雾-质谱( ESI-MS) 进行分析，成功实现了MCF-7中染料木黄酮及其代谢物的定性和定量的测定。
该实验构建的细胞水平的药物筛选微流控芯片平台，集系统药物浓度梯度生成、芯片细胞培养、细胞标记和洗涤以及SPE微柱纯化等操作单元于一体，可在一次运行中获得多个实验参数，不仅简化操作、节省试剂，更容易满足高通量药物的筛选。
由于在填充柱的制作中，固定相微粒是往往是被柱塞堵截后堆积到微通道中的，在样品前处理过程中，常会发生固定相微粒自身不断紧密堆积所致的萃取重复性变差的现象，影响了填充柱的性能。
为克服此类劣势问题，有学者尝试利用凝胶-溶胶(sol-gel)技术把填充于微通道中的固定相微粒固定后，形成连续填充柱，并已取得了良好的进展。
在固定化过程中，特别是一些蛋白类物质可以在sol-gel网络中被富集而不丧失活性，大大提高了固相萃取填充柱的吸附容量。
例如，Landers课题组利用sol-gel作为粒间粘胶剂，将填充好的二氧化硅颗粒固定在玻璃芯片微通道内( 2.2 cm long，60 μm deep，400 μm wide)，成功的从全血中的分离出DNA，柱子的重复性和稳定性良好，整个分析过程控制在30 min之内即可完成。
又如 Karwa在利用sol-gel技术将十八烷基硅氧烷( ODS)颗粒填充在PDMS芯片通道内(2 cm long，300 μm deep，425 μm wide) 用于大肠杆菌 DNA的富集，并通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，得到较满意的结果。
与开管柱相比，固相萃取填充柱的负载容量大大提高，较容易实现高倍富集，应用也更广泛。
但由于在制备填充柱时候，柱塞的制备比较困难，且在微通道内填充固定相耗时且费力，有时填充柱的均匀性也较差，影响到萃取效率和重复性。这对于进一步发展芯片上的固相萃取技术又提出了更高的要求。
整体柱
固定相如果直接在通道内形成，则称之为整体柱，作为近几年发展起来的一种新型的固相萃取吸附剂，整体柱又称为整体固定相、棒状柱、连续床层等。它通常由微加工法或原位聚合法制备而成。
微加工法指的是直接在微通道内加工出含有固相萃取吸附剂的微型整体柱，无需在芯片内设计类似于双围堰固相萃取填充柱中的固定相引入通道，一定程度上简化了芯片的设计。目前，该类整体柱已经成功应用于核酸的分离和纯化。
原位聚合法是制备整体柱较常用的一种方法，该法通过热诱导、微波引发或光引发的方式，使聚合物单体、引发剂以及致孔剂等反应混合物在芯片通道内直接发生聚合反应，在柱体内原位生成多孔介质作为整体柱。该法具有三大优势: 首先，避免了微加工制作整体柱时所需的高精度加工技术的要求;其次，聚合反应体系的多样性丰富了固定相的种类;
再者，通过改变单体溶液的组成和浓度，可以方便的控制整体柱的表面性质、孔径大小和孔隙率，使之适应于不同的吸附模式。这样制备出的整体柱具有高通透性、多孔性和大的比表面积，确保其能在分离分析工作中达到高效快速、高通量和低背压的萃取效果。
因此整体柱被誉为继多聚糖、交联与涂渍单分散之后的第四代色谱填料，在微流控芯片系统分离富集技术的发展与应用中极具潜力。
原位聚合整体柱按原料类型的不同可分为溶胶-凝胶整体柱和有机聚合物整体柱。溶胶-凝胶整体柱通常是在烷氧基硅烷(四甲氧基硅烷 TMOS) 中加入一定比例的催化剂、制孔剂等，将此体系混合成溶胶状态，在醋酸的催化下，通过光引发或热诱导而产生的。
Yamamoto等在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 芯片上制作出长为0.5 mm的聚丙烯酰胺凝胶柱，以荧光检测器检测FITC标记的蛋白质和多肽，富集倍数可达10^5。
此外，为提高整体柱的特异性选择，也可在此类整体柱上修饰特定的官能团，以实现某一类物质的萃取和富集。
有机聚合物整体柱按具体的原料不同可分为聚丙烯酸酯类和聚苯乙烯类等。与开管柱和填充柱相比，有机聚合物整体柱具有较大的吸附表面，且结构均匀，具有强度高、流阻小，渗透性好等优点。
目前，这方面的相关研究工作较多，例如，Qu等在芯片内原位聚合了以丙烯酰胺为功能单体的分子印迹整体柱，结合安培检测器，在75 s内实现了两种色氨酸同分异构体的拆分。
由于分子印迹整体柱具有高选择性和专一性，这类分子印迹类整体柱对于高通量手性化合物分离检测极具应用潜力。
作为一种重要的样品前处理和富集技术，固相萃取在微流控芯片上的应用备受关注。微流控芯片技术易与质谱、电泳等技术联用，可以将样品制备、预处理、分离和检测等集于一体，故芯片上的固相萃取技术在降低分析的复杂性和所耗的时间的同时，也促进了分析仪器的集成化、微型化发展。
因此，发展性能优异的固相萃取材料及针对样品体系开发合适的固相萃取技术，以实现样品的分离富集，不仅推动了微流控芯片系统的自身发展，在开发高通量、快速的样品制备技术中也极具潜力。
