看表观新修饰-6mA甲基化如何助力IF飙升!
DNA甲基化修饰是表观遗传研究的热点之一，我们通常认为DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），却不知道随着测序技术的快速发展，科研者们已经在真核生物中（果蝇 、真菌、莱茵衣藻、秀丽隐杆线虫等）发现了一种新的DNA甲基化修饰—DNA-6mA甲基化，且DNA-6mA甲基化能影响基因表达，在动植物的生长发育过程中发挥着关键的调控作用，同时与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。这些发现成功地掀起了科学家们对DNA-6mA的研究热潮，使DNA-6mA成为表观遗传学领域的研究热点中的热点。接下来就以几篇经典案例为大家介绍DNA-6mA。
DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.NATURE, IF: 44.958
作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三种技术相结合的方法研究小鼠基因组甲基化。研究发现小鼠胚胎干细胞中存在另一种DNA甲基化修饰—6mA甲基化；Alkbh1是腺嘌呤甲基化修饰的一种去甲基化酶，在Alkbh1基因缺失突变小鼠细胞中腺嘌呤甲基化水平增加，进而导致转录沉默。揭示了哺乳动物表观修饰的重要组成部分—6mA甲基化，在哺乳动物中发挥沉默基因表达的功能，而不是如其他生物体中激活基因表达的作用。
6mA分析 6mA与基因表达的关系
6mA-IP seq分析
N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.Cell, IF: 31.398
作者以果蝇胚胎干细胞为材料，对其基因组中6mA修饰进行研究，发现在果蝇基因组中6mA修饰广泛存在，这种修饰受內源去甲基化酶DMAD调控，在胚胎发育过程中呈动态变化。进一步研究发现，DMAD酶作为果蝇胚胎发育所必须的一种酶，它作用于转座子的6mA位点，去甲基化后，转座子的表达受到抑制。该文章发现果蝇中DNA甲基化修饰新类型-6mA，并且初步探究了6mA甲基化的调控机制。
6mA分布 mA体外去甲基化分析
6mA-IP seq与RNA-seq联合分析
N6-Methyldeoxyadenosine Marks Active Transcription Start Sites in Chlamydomonas. Cell, IF: 31.398
文章利用三项6mA研究技术：6mA-IP-Seq、6mA-CLIP-Exo、6mA-RE-Seq对果蝇基因组和衣藻基因组中的6mA修饰进行研究。发现在果蝇基因组中84%的基因稳定的存在6mA修饰。且6mA主要以双峰形式分布在TSS区域，与核小体分布相关，呈周期性分布。进一步结合RNA-seq技术发现，6mA与基因表达有紧密关系。而衣藻的基因组中的6mA甲基化修饰又有新的特点，6mA修饰主要分布在转录起始位点区域，以双峰形式分布。其主要序列特征为C6mATG和G6mATC。接着通过对RNA-seq检测到的高表达基因和低表达基因分析，发现高表达基因的TSS附近的6mA富集程度较高，而低表达基因的TSS附近的6mA富集程度较低，与5mC的分布特点相反。通过这些数据说明真核生物中的6mA修饰能够调控基因表达。
6mA的分布特征 motif分析
peak分析
N6-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome.Molecular Cell，IF: 14.248
RNA-6mA在前期的研究中已被证实对基因表达有重要的影响，但是对于DNA-6mA在基因表达方面的相关作用，研究并不是很清楚。而本篇文章作者首先利用6mA-IP-seq技术，通过对DNA -6mA修饰图谱分析发现：高表达水平基因的外显子区域具有较高的6mA丰度，并且与RNA表达水平正相关；6mA修饰位点在G蛋白偶联受体(GPCR)相关基因中有显著的富集，预测了6mA甲基化在GPCR相关基因表达调控中可能发挥重要作用。接着通过6mA-IP-qPCR、ALKBH1基因和N6AMT1基因的敲除和过表达等实验，阐述了DNA-6mA甲基化的调控机制。总的来说，本篇文章的意义在于：首次破译人类DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）修饰图谱，揭示了DNA-6mA甲基化修饰在人类基因组中的调控机制和生物学功能。
DNA-6mA相关分析
云序生物 -6mA-IP -seq一站式服务
云序生物率先开发了DNA-6mA测序技术—。其原理类似于MeDIP的免疫共沉淀测序技术，利用特异性抗体富集6mA片段，扩增后进行高通量测序及甲基化分析，以较小的数据量，快速、高效地绘制全基因组DNA甲基化水平的图谱。
1、技术服务
一站式服务：
客户只需提供相关样品的基因组DNA，云序生物为您完成从6mA-IP富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。
优化的实验流程：
6mA-IP的富集效率是决定数据质量的关键，云序生物6mA-IP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程，具有极高的效率和特异性。
严格的质控：
实验的各个关键步骤进行严格的质控，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。
专业的生物信息学分析：
云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。
2、样本要求
样品类型：无降解且无RNA污染的DNA样品(适用所有有参考基因组的物种)。
样品需求量：不少于10ug
样品浓度：不少于50ng/ul
样品运输及保存：
样品运输：样品置于1.5mL Eppendorf 管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可用冰袋运输。
样品保存：细胞样品或新鲜组织块切块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品短期内可-20℃，避免反复冻融。
3、数据分析
标准分析：
（1）DNA甲基化富集峰的识别
通过高通量测序和生物信息分析，识别甲基化富集的基因组区域，默认p <= 1e-5（具体参数以报告为准，云序生物会根据数据，适当调整参数）的峰为统计上显著的甲基化区。
注：每个样品组做一个Input，以去除基因组背景，降低假阳性率。
（2）DNA甲基化区域富集峰的注释
富集峰识别后，得到的是一堆基因组位置信息，通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释，并根据峰中点相对于已知基因的位置，将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。
（3）DNA甲基化富集峰区域的在基因中的分布
（4）差异DNA甲基化区域的鉴定（DMRs）与注释
云序生物使用diffReps软件进行差异甲基化区（differentially methylated regions，DMRs）鉴定。默认p-value<0.0001，fold change >=2作为差异甲基化区的阈值。
（5）差异DNA甲基化区的GO（Gene Ontology）与信号通路分析
目的：对差异甲基化基因进行功能分类，并发现显著性富集的功能条目。
（6）DNA甲基化可视化
高级分析：
（1）DNA甲基化位点motif分析
通过序列分析结合生物信息学手段就可确定DNA甲基化修饰偏好序列，找到DNA甲基化特征Motif。
（2）DNA甲基化位点共有和特异性分析
根据注释信息，绘制组间共有和特异性的甲基化修饰位点或基因。
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