基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法(3)
RN A提取方法
下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。
异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎， 核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。
RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA分子。
因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。
200µl血清（浆）
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加入200µl 20%PEG6000
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4oC，3小时，12000rpm，4℃离心15分钟
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弃上清，加500µl裂解液（含异硫氰酸胍、-β巯基乙醇等），混匀
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加50µl NaAc，500µl饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1），充分混匀，冰浴10分钟
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4℃12000rpm，离心5分钟
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小心吸取上层水相移至一新离心管中，避免吸取两相之间的蛋白质，用氯仿-异戊醇再抽提一次
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加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟
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4℃12000rpm，离心10分钟
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弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65℃烘干
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用10µl DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin
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-20℃保存备用
（三）核酸提取的其他方法(简单介绍):
胍盐提取结合二氧化硅吸附法
二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。
2.TRIzol 试剂提取RNA方法：
TRIzol试剂盒是由GIBCO BRI公司推出的产品，其操作方法简单方便，一小时内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有RNA，中间层含DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。
3.旋转离心柱提取
旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱虽各有特色，但在原理上通常可分为三个部分：
利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。
把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。
把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。
此法也可用于DNA测序前核酸的纯化，又叫过柱纯化。
旋转离心柱技术具有广泛的发展前景，该产品可应用于生物学、遗传学、免疫学、考古学、法医学等各方面的基因分析。
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