碳纳米管分散固相萃取霉菌毒素和抗菌类药物的研究

饲料中p-受体激动剂、抗菌类药物等非法添加以及饲料中霉菌毒素污染等三大影响饲料安全的最主要问题,影响到肉、蛋、奶等动物产品的品质,制约了畜牧业的可持续发展,并危害到消费者的健康。因此,建立饲料中三大类主要化学污染物的检测方法,在此基础上对饲料质量进行监测和控制具有重要意义。但是,由于饲料样品基质的复杂性,已建立的饲料中化学污染物检测方法存在前处理过程复杂、单组分检测费时费力、结果准确性差、检测效率低、前处理成本很高、有机试剂用量大等问题。本研究旨在建立饲料中p-受体激动剂、霉菌毒素、抗菌类药物等三大类主要化学污染物快速、高效、多组分同步检测技术,有效保障饲料质量安全。 本论文以玉米赤霉烯酮类霉菌毒素(雷索酸内酯)、p-受体激动剂、磺胺类和喹诺酮类药物等为研究对象,深入研究了饲料中化学污染物多组分同步检测的样品前处理技术和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法。在样品前处理方法研究中使用了近年来引起广泛关注的碳纳米管材料和分散固相萃取技术,有效提高了前处理效率。仪器分析过程中采用UPLC进行快速分离,用串联质谱进行定性、定量检测。同时,运用同位素稀释定量技术进行校准,提高了定量方法的准确度和精密度。主要研究内容及结果如下： 1.β-受体激动剂质谱裂解机理研究 本研究以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等为代表,阐明p-受体激动剂在正离子软电离模式下的裂解机理。采用AB SCIEX5500QTRAP三重四级杆电喷雾质谱仪,运用IDA-EPI技术,对p-受体激动剂类化合物裂解规律进行研究解析。结果表明,由于β-受体激动剂均属于苯乙醇胺类化合物,但苯环上及氨基连接官能团有差异,所以它们的ESI-MS/MS行为存在着相似性和差异性。在ESI正电离模式下p-受体激动剂容易获得H+而形成[M+1]+准分子离子峰,该结构易丢失水分子(H20),继而与氨基结构相连的碳氮键(-C-N-)键发生断裂,形成与苯环共轭的(Ph-CH=CH-NH+-)离子结构。本研究为同类化合物的结构解析研究提供可靠的依据,为跟踪新型β-受体激动剂提供有力手段,具有较强的理论意义和实用价值。 2.多壁碳纳米管分散固相萃取结合LC-MS/MS测定饲料中11种β-受体激动剂研究 采用多壁碳纳米管(MWCNTs)为吸附剂,建立分散固相萃取(dSPE)净化、超高效液相色谱-串联质谱测定饲料中11种p-受体激动剂(克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、氯丙那林、妥布特罗、西马特罗、特布他林、马布特罗、班布特罗和喷布特罗)的方法。本研究对样品前处理方法进行了系统优化,包括MWCNTs用量和类型、提取液pH值、MWCNTs提取时间以及洗脱液体积等,以提高检测方法通量和灵敏度。以0.1%甲酸溶液和甲醇为梯度洗脱流动相,采用ESI+模式电离,在MRM模式下建立了LC-MS/MS测定方法,内标法校准定量。研究结果表明,11种p-受体激动剂在0.1-20μg/L浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数r2均大于0.997,猪配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料样品中LOQ为0.05-0.48μg/kg；添加水平为0.5-100μg/kg时,11种p-受体激动剂的回收率在89.6%-112.9%,RSD均小于15%。该检测方法与农业部1486号公告的方法进行了比较,两种方法检测结果一致,说明新建立的多壁碳纳米管分散固相萃取结合LC-MS/MS测定饲料中11种β-受体激动剂的方法操作简便、稳定性好、准确度和精密度高。 3.多壁碳纳米管结合LC-MS/MS测定饲料中6种玉米赤霉烯酮类霉菌毒素 研究以多壁碳纳米管(MWCNTs)为吸附剂,建立分散固相萃取(dSPE)净化、液相色谱-串联质谱测定饲料中6种玉米赤霉烯酮类霉菌毒素(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮)的方法。本研究对样品前处理方法进行了优化,包括提取液pH值、MWCNTs提取时间与MWCNTs用量和类型以及洗脱液体积等,以提高检测方法通量和灵敏度。以水和乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用ESI-模式电离,在MRM模式下建立LC-MS/MS测定方法,内标法校准定量。研究结果表明,6种玉米赤霉烯酮类霉菌毒素在1.0-500μg/L浓度范围内呈现良好的线性关系,相关系数r2均大于0.9991；LOD为0.12-0.27μg/kg,LOQ为0.40-0.90μg/kg;在1.0μg/kg-500μg/kg添加浓度水平上,猪配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料样品中平均回收率在94.6%-107.2%,批内RSD在2.6%-8.5%之间,批间RSD在4.5%-9.2%之间。将本方法检测结果与农业行业标准NY/T2071的方法进行了比较,两种方法阳性样品检测结果RSD在15%以内,表明新建立的多壁碳纳米管结合LC-MS/MS测定饲料中6种玉米赤霉烯酮类霉菌毒素的方法简便、快速、准确度和精密度高。 4.碳纳米管分散固相萃取结合LC-MS/MS测定饲料中22种磺胺类和喹诺酮类药物 研究建立多壁碳纳米管(MWCNTs)为吸附剂的分散固相萃取(dSPE)净化、液相色谱-串联质谱测定饲料中22种磺胺类和喹诺酮类药物(磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶林、磺胺氯哒嗪、氟甲喹、诺氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星、奥比沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星)的方法。本研究对样品前处理方法进行了系统优化,包括MWCNTs用量和类型、提取液pH值、MWCNTs提取时间以及洗脱液体积等,以提高检测方法通量和灵敏度。以0.1%甲酸溶液和乙腈为梯度洗脱流动相,采用ESI+模式电离,在MRM模式下建立了LC-MS/MS测定方法,内标法校准定量。研究结果表明,22种磺胺类和喹诺酮类药物在1.0-1000μg/L浓度范围内呈良好的线性关系,线性相关系数r2均大于0.992,LOD为3.0-10μg/kg, LOQ为10-25μg/kg,猪和鸡的配合饲料、预混合饲料和浓缩饲料中添加水平为0.05-50mg/kg时,其回收率在71.5%-114.7%之间,批内RSD在1.5%-12.5%之间。利用该方法对本中心保留的1份磺胺喹恶啉阳性饲料样品进行了检测,并与GB/T19542的方法进行了比较,两种方法检测结果一致,表明新建立的碳纳米管分散固相萃取结合LC-MS/MS测定饲料中22种磺胺类和喹诺酮类药物的方法检测效率高、成本低、结果准确可靠。