粘膜病病毒诊断

(1) 检测病毒和病毒抗原： 　

　① 病毒分离：急性粘膜病具有持续的病毒血症，所以血液是最好的病毒分离材料。 采取凝固血块，经冻融几次后作为接种物。尸体剖检时则采取肠系膜淋巴结或脾脏，也 可应用骨髓。　　检查局部感染时，可用棉拭子采取局部的分泌物或排泄物，置入含有高浓度抗生素 的运输液中(每ml 5 000 u的青、链霉素和10μg的两性霉素B)。　　不能及时接种的病料，应冰冻保存，以免降低或丧失感染性。　　各种牛源细胞均可用于病毒分离，包括牛肾和胎牛肺原代细胞或继代细胞以及犊牛 睾丸细胞。犊牛原代睾丸细胞常可显示较好的细胞病变。　　犊牛原代睾丸细胞应用加有酵母浸膏和10%犊牛血清的乳白蛋白水解物作为生长液。 长成单层后，应用加有2%犊牛血清的199液作为维持液。其它细胞的培养液相同。 必须 注意，所用的血清应该不含BVDMD病毒抗体。　　某些毒株在合适条件下产生细胞病变，使用上述犊牛原代睾丸细胞和生长液，偏碱 的pH以及转管培养方法，有利于细胞病变的出现。不同毒株产生的细胞病变不尽相同， 某些毒株在连续传代以后才出现细胞病变。 BVDMD病毒不形成包涵体。　　分离株如果引起细胞病变，则应进一步用抗BVDMD病毒的免疫血清进行中和试验鉴 定之。不论各毒株之间的抗原性差异如何，如果BVDMD特异血清对新分离毒株的中和效 价≥100，即可证明是BVDMD病毒。　　由于无致细胞病变作用的BVDMD病毒株常能干扰另一株有致细胞病变作用的毒株产 生细胞病变，因此可以应用蚀斑减数试验证明这类毒株的存在。

② 动物接种：选用未感染过BVDMD的6月龄健康犊牛,隔离观察半个月,确证无病后,每头 犊牛 接种待检血液或病料乳剂(按常规要求处理)50ml,其中40ml作静脉注射,10ml作滴鼻接种。 此 后每天进行临床观察和体温测量,并定期采血作病毒分离和血清抗体检测。

③ 琼脂扩散试 验：存在于病畜肠粘膜、肠系膜淋巴结、胰腺以及发 生病变的其 它组织中的沉淀抗原，可用琼脂扩散试验检出。方法是选取发炎或糜烂和溃疡周围的粘膜， 不经任何处理，直接与阳性血清进行琼脂扩散试验。据统计，约有60% 的病牛呈现阳性 反应。

④ 电镜检查：获得的新鲜病料或细胞培养 物可直接用负染法，在电镜下观察病毒粒子的特征。也可用铬投影的电子显微照相测量 病毒的 大小和形态。病毒粒子呈球形，直径35～55nm，有囊膜(无突起)和一个直径约24～30nm的病 毒核心。也可制作超薄切片标本后检查,病毒粒子存在于胞浆、空泡和扩张的内质网池内,形 态比较规整,常有囊膜，大小约60nm。

⑤ 免疫荧光染色：BVDMD病毒的特异性免疫血清以往用山羊或牛制备。后来发现， 用 猪 制备的抗血清在用荧光素标记后较少出现非特异性荧光。经鼻道给猪感染BVDMD病 毒，经1个月后用猪瘟强毒攻击。在攻毒后14～21天分离血清，56℃灭活半小时后提取I gG，-20℃保存备用。　　有关IgG提取以及荧光素的标记方法，请参阅本书第十四章。　　应用荧光抗体技术(通常用直接法)可以检测感染细胞培养物(飞片)以及病变组织冰 冻切片中的病毒抗原。荧光颗粒出现于胞浆中，并可应用未标记抗体进行荧光抑制试验 作进一步鉴定。

⑥ 双抗体夹心ELISA：王新平等建立了双抗体夹心ELISA检测BVDV,给本病的诊断、检 疫提供了一种简便、有效的手段。

⑦ 核酸探针杂交试验：是直接检测血细胞和脏器组织中BVDV高度特异和灵敏的 方法并在临床上得到初步应用。
⑧反转录多聚酶链式反应(RTPCR)：根据BVDV病毒基因组序列合成一对或数对引物，应 用 RTPCR　可以高度特异、灵敏地检测器官、组织、培养细胞中的BVDV，并区分不同的BVDV 株或与猪瘟病毒、边界病毒相区别。　　牛在妊娠前3个月感染非致细胞病变型BVDV,可引起流产、 死胎或先天性感染以及 生产免疫耐受性的犊牛。先天性感染的牛一般外观健康，但一旦感染致细胞病变型BVDV,则 常常死于粘膜病。畜群中先天性感染牛所占百分比一般较小，但却足以起到传播作用， 使整个牛群长期带毒。因此检出和清除这些感染牛是很重要的。目前常用的BVDV 分离和抗原检测技术,如免疫荧光试验和细胞培养方法等耗时，繁琐，不能快速得出诊断结 果。RTP CR可以快速敏感地检出BVDV，与核酸探针结合起来，更可将灵敏度提高到一个新水平