新型全转录组单碱基分辨率N6-甲基腺苷（m6A）检测方法
在已知的100多种RNA化学修饰中，N6-甲基腺苷（m6A）是真核细胞mRNA中最丰富的形式之一，占所有腺苷的0.1%~0.4%。m6A修饰可影响mRNA代谢的不同阶段以及长非编码RNA和microRNA产生，是RNA和表观修饰领域的重要研究方向。已有研究表明，m6A能够影响多种生物学过程，包括神经元发育、细胞命运转变、免疫反应、DNA损伤反应和肿瘤发生等。因此精准定检测m6A对了解其与人类发育和常见疾病的广泛联系有着重要意义。
由于m6A的化学性质与腺苷类似，所以难以通过化学反应进行鉴别。为准确鉴定m6A，科学家开发了多种检测方法。甲基化RNA免疫共沉淀测序(merip-seq或m6A-seq)已被广泛用于m6A分析，但其精确度较低。虽然也有很多检测方法在分辨率方面进行了改进，例如PA-m6A-seq、miCLIP和m6A-CLIP，但这些方法都依赖于m6A特异性抗体。由于抗体存在亲和力变化和批次效应等问题，难以准确量化甲基化水平。此外，以上检测方法的重复性差、样品需求量大、检测过程比较复杂。因此，开发一种简便的单碱基分辨率方法进行全转录组m6A的鉴定和定量，有助于提高人们对m6A生物功能的理解。
近日，中山大学骆观正教授联合美国芝加哥大学何川教授领导的研究团队开发了一种新的高通量m6A鉴定方法（m6A-sensitive RNA-Endoribonuclease-Facilitated sequencing，m6A-REF-seq），该方法基于新发现的RNA内切酶MazF对m6A的敏感性，能够以单碱基分辨率量化甲基化水平，对全转录组范围的m6A进行精准检测，且不依赖于抗体，克服了传统m6A鉴定方法的局限性。7月3日，相关研究成果发表在Science Advances上，文章题为“Single-base mapping of m6A by an antibody-independent method”。
为开发高效的鉴定方法，研究团队通过筛选内切核糖核酸酶库，发现了2种能够区分m6A和未甲基化腺苷的酶：MazF和ChpBK。经过裂解分析，MazF具有更高量化甲基化水平的潜力。在筛选出对m6A敏感的MazF酶后，研究团队利用其开发的m6A-REF-seq可以识别特定序列的转录组m6A位点，并能以单碱基分辨率量化甲基化水平，如图1。
图1. 基于m6A敏感性RNA内切核糖核酸酶的m6A鉴定方法。（A）验证MazF的甲基化敏感性。（B）验证ChpBK的甲基化敏感性。（C）含有m6A的寡核苷酸与内切核糖核酸酶消化的未甲基化寡核苷酸混合的各种比例。（D）内切核糖核酸酶消化的按比例混合的RNA寡聚物的相对灰度。（E）m6A-REF-seq检测的示意图。
为了降低假阳性，确保m6A-REF-seq鉴定m6A位点的可靠性，研究人员使用m6A去甲基化酶FTO在体外处理mRNA作为对照，只有在FTO处理组中甲基化比例降低的位点才被认为是准确的m6A位点。同时，研究人员也使用RNA二级结构预测软件对备选m6A位点附近的二级结构进行预测，并去掉受二级结构影响的位点。
图2. m6A-REF-seq数据分析流程
利用m6A-REF-seq技术，研究人员对HEK293T细胞系的m6A修饰进行了鉴定。研究发现，该方法具有高灵敏度和特异性。研究人员共获得4260个高置信度的m6A位点，这些位点的分布与MeRIP-seq测序结果非常相似。此外，m6A-REF-seq生成的全转录组单碱基分辨率m6A图谱可以定量的显示终止密码子附近富集的线性分布模式，且发现其主要存在于经典的DRACA或RRACA motif中。
图3. 其他m6A鉴定方法验证m6A-REF-seq的准确性与可靠性
为验证m6A-REF-seq的准确性和可靠性，研究团队利用独立方法验证了单个m6A位点的甲基化状态和丰度，如图3。不同方法检测结果的高度一致性证明m6A-REF-seq具有高效率和高度可靠性、准确性。利用qPCR，研究人员证实m6A-REF-seq方法可以量化特定m6A位点的甲基化水平，如图4。此外，研究人员将m6A-REF-seq应用于人、小鼠和大鼠的五种组织，发现m6A位点具有单核苷酸特异性，且倾向于在物种间聚类。
图4. 利用qPCR验证m6A-REF-seq量化特定m6A位点甲基化水平的能力
在转录组水平上全面解析m6A是揭示这种mRNA修饰生物学意义的关键。骆观正教授以及何川教授领导开发的m6A-REF-seq技术具有更高的灵敏度和更低的假阳性率，并且摆脱了传统鉴定方法对抗体的依赖性，同时大大降低了样本起始量，使得某些稀缺样品也能进行m6A研究。高效便捷的m6A-REF-seq技术为转录组单碱基水平的m6A鉴定提供了新的方法和视角，有助于大幅提高m6A研究的范围。
参考资料：
Single-base mapping of m6A by an antibody-independent method
https://advances.sciencemag.org/content/5/7/eaax0250
