分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

RNAi常见问题及问答（FAQs）

2019.8.02

有关Stealth™ RNAi的问题

什么是Stealth™ RNAi？
Stealth™ RNAi是RNAi化学的新一代产品。Stealth™ RNAi分子是经过ZL化学修饰的、钝末端、双链25聚体（25mer）。这些化学修饰专门用来消除诱导的细胞应激反应。它也使Stealth™ RNAi比标准的siRNA在血清中更稳定，通过确保Stealth™ RNAi双链中只有反义链进入RNAi通路，减少脱靶效应（off-target）的可能性。

如何设计Stealth™ RNAi？
RNAi Designer 免费在线工具是设计有效Stealth™ RNAi的理牍ぞ摺NAi Designer使用独特的、基于公开设计法则的算法（algorithm），复杂的同源消除以及获得的来自invitrogen广泛的成功的RNAi实验室数据。使用RNAi Designer，你可以设计独一无二的Stealth TM RNAi分子，来靶定目的mRNA分子，进行有效的基因阻断。如果你现在已经有一个效果良好的siRNA 序列，把它转变成有效的双链Stealth™ RNAi非常简单，同时你可以获得Stealth™ RNAi所有的优点。

如何知道siRNA或者Stealth™ RNAi不会靶定其它的基因？
RNAi Designer利用严格的设计法则选择Stealth™ RNAi，选择的Stealth™ RNAi对于你所选择的有机体是独一无二的。由于只有反义链能够产生RNAi反应，因而Stealth™ RNAi是消除这些问题的最有效的方法。

我需要多大量Stealth™ RNAi？
Stealth™ RNAi以20 nmole 退火双链提供，提供24孔板大约2000次转染。如果有要求，invitrogen可以提供大规模选择序列的合成。

如何我能够知道使用什么序列？
你可以使用RNAi Designer在线工具设计Stealth™ RNAi的序列。Invitrogen 客户服务也可以帮助你设计和在目标细胞类型中验证序列。

Stealth™ RNAi有多稳定？我能够在体内研究中使用它吗？
在血清中Stealth™ RNAi明显的要比siRNA稳定。增加稳定性特别有利于体内研究，在体内RNAi可能暴露到更多的核酸酶中。通过与Introdigm合作，已经证实Stealth™ RNAi体内肿瘤内注射具有活性。

是否BLOCK-iT™ Basic RNAi Control Kit 和 Transfection Optimization Kit中的荧光oligo（fluorescent oligo）修饰作Stealth™ RNAi？
荧光oligo是修饰的荧光标记的dsRNA。RNA上的这种修饰促使它以一种清晰和稳定的方式定位到细胞核，使得它成为转染的一种出色的对照。相反，简单的荧光素标记的siRNA导致模糊的模式，难以区分荧光oligo是进入细胞或者是仅仅黏附到细胞的外面。

我是否可以使用BLOCK-iT™荧光oligo优化质粒转染？
已经显示BLOCK-iT™荧光oligo的转染与Stealth™ RNAi和siRNA的转染相关，但是DNA和BLOCK-iT™荧光oligo的相关性还没有进行检验。

一般RNAi问题：

RNA干扰（RNAi）是如何被发现的？
1990年，Jorgenson 和 Mol在研究一种模式植物系统的工作中，第一次发现RNA干扰现象存在的迹象。存在天然色素基因附加拷贝的矮牵牛花（Petunias）似乎以某种方式同时阻断了天然和插入色素基因的表达，被称之为协同抑制。几年后，研究烟草的另外一个小组发现，病毒能够启动特异基因的抑制。Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello在实验室中发现注射dsRNA到线虫（C. elegans），导致与导入dsRNA同源的那些特异基因表达的沉默，而后，在1998年nature上发表的文章中创造了术语RNAi 。

RNAi 天然生物学功能是什么？
几乎所有的植物和动物细胞都具有利用siRNA的内部机制，使用siRNA抑制特殊基因的表达。RNAi进化的机制，似乎是为了保护基因组免于内源转位因子和病毒感染的损害。RNAi可能在细胞中有正常的功能性作用，在生长和发育期间抑制一些基因的表达。

RNAi优于用来进行组断基因表达的其它方法的优点是什么？
基因敲除和转基因动物是功能缺失表型研究的主要方法。然而，获得这些动物是一个漫长而且费用昂贵的过程，同时很多基因的缺失会导致胚胎致死表型，使得基因敲除变得不再可能。
灭活蛋白功能的方法包括结构域阴性突变构建和分析，和使用抗体和aptamers。但是，这可能需要花费一些时间确定什么构型和结构有功能，而且它们似乎只对某些靶标有作用。
有两种方法被用来调节mRNA的更新，反义mRNA和核酶（ribozyme）。但是这两种方法的应用有很大的限制。
RNAi是快速鉴定基因功能而费用低廉的方法，似乎对于到目前为止检测的大多数基因效果良好。RNAi迅速成为在敲除目的基因表达方面使用更多的方法。RANi对于了解基因功能，信号通路分析，RNAi机制研究和靶标验证非常有用，同时展示了诊断学和治疗学的巨大潜力。

获得短的干扰RNA（siRNA）的方法有哪些？
获得导入哺乳动物细胞siRNA的3种最常用的方法：
· 体外转录和Dicer酶切（dicing）
· 合成siRNA
· 带有RNAi框的载体

siRNA和diced siRNA（d-siRNA）之间有什么差别？
二者的分子结构是相同的，dicer将长dsRNA特异的裂解为21-23个核苷酸双链，具有siRNA标志的两个核苷酸的突出。主要的差别是d-siRNA是包含一个来源于一个完整全长的dsRNA靶标的siRNA库，而siRNA通常是指特异针对专门靶定区域的单一序列，通常合成为单一Oligo或者特异几种Oligos混合物。

如何测量RNAi的效果？
检测基因特异阻断的最常用的方法是进行western blot分析，比较导入siRNA前后蛋白表达水平的变化。在一些情况下可能使用检测报告子基因的报告子系统例如β-半乳糖苷酶。也可以应用实时PCR（例如通过使用LUX™引物）或者其它类型基于细胞的分析检测细胞中转录本的水平。

如何知道什么序列具有RNAi效应？
为了分析特异siRNA序列在基因活性上的效应，必须知道导入siRNA的序列。这将要求设计合成寡核苷酸或者载体上的短的发夹RNA（siRNA）序列，转染后检测基因的阻断。而dicer酶切的siRNA（d-siRNA）导入细胞后，由于d-siRNA库中通常都有好几种有效的siRNA序列，它们在起始RNAi反应尤其有效。然而目前还没有方法确定在这个库中起作用的特异的序列。

有关BLOCK-iT™载体的问题：

为什么使用载体导入shRNA？
在哺乳动物细胞中，RANi可以通过直接导入特异阻断所选择基因表达的分子而诱导，导致产生基因功能缺失表型。这些分子可以通过化学合成、体外方法制备或者细胞内DNA模板产生。前两种方法只能用于瞬时阻断，可能很难导入难以转染的、不分裂的或者原代细胞类型。通过载体导入pol III 启动子表达的短的发夹RNA（shRNA）扩展了RNAi实验的选择，包括稳定和可诱导表达以及病毒导入。

为什么使用pol III型启动子？
使用pol III型启动子是为了有效表达shRNA。这些pol III型启动子包含了表达RNA上游所有的必要的元件，而且在一个短的多聚胸苷区内终止。一旦shRNA被表达，它被转移出细胞核，在细胞质中被Dicer加工成siRNA。Dicer优先识别由 pol III型启动子产生的shRNA，因为它们不带有5’或者3’两侧连接的序列。siRNA进入RISC复合体中，在哺乳动物细胞中产生RNAi效应。

H1启动子和U6启动子有什么差别？
BLOCK-iTTM可诱导H1和U6入门载体试剂盒（BLOCK-iT™ Inducible H1 and U6 Entry Vector Kits）分别使用Pol III依赖H1或者U6的启动子。H1启动子经过修改，其中包含两个四环素操纵子2（tetracyline operator TetO2），允许从这个启动子表达的shRNA在表达四环素抑制（TR）蛋白的细胞中调节表达。尽管H1和U6是polⅢ 型启动子，然而可能根据使用细胞系的不同，效率有些小的差别。

什么时候应该使用pLenti6/TR？
pLenti6/TR是基于慢病毒的载体，可以产生在CMV启动子控制下高水平表达四环素抑制子（TR）的稳定细胞系。使用慢病毒导入方法意味着，基因可以特别有效地导入和高效地整合到难于转染的细胞、原代和不分裂细胞中。表达TR的细胞能够使用杀稻瘟菌素（Blasticidin）进行筛选。pLenti6/TR载体设计可以与BLOCK-iT™可诱导H1慢病毒RNAi系统以及ViraPower™ T-REx TM慢病毒表达系统一起使用。

有关BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit和BLOCK-iT™ Dicer RNAi Transfection Kit问题：

什么时候使用体外Dicer酶切方法最好？
Dicer是进行早期RNAi分析的出色的工具，提供：
· 产生申请基金和发表文章所需要的有效的RNAi数据
· 若干基因的最初筛选，以选择那一个是最有兴趣跟踪的基因
· 分析基因某一特殊部分的阻断效应
· 敲除某一特殊基因的所有剪切体或者所有的家族成员

使用d-sRNA进行RNAi分析时，我能预期看到脱靶背景吗？
考虑以什么序列作为Dicer的底物是重要的。尽管我们生产能够阻断基因表达的更小的siRNA双链（∽200碱基）上一直是很成功的，但是Dicer切割500-1000碱基的长的ds-RNA效果最好。选择目的基因合适的区域扩增和转录也是很重要的。为了避免非特异的阻断效应，不要转录保守区域，选择一个对于目的基因特异的基因区域。Dicer的独特性在于，它也能提供扩增保守基因区域的机会，因而如果需要，整个基因家族的表达可能被阻断。

使用Dicer和RNaseIII裂解dsRNA有什么差别？
RNaseIII酶裂解长的ds-RNA明显的要比Dicer裂解的片段小（12-15核苷酸）。有报道表明，这些裂解的片段可以有效的产生RNAi效应，尽管可能需要更多的产物转染以达到阻断。Dicer酶是真核细胞内源RNAi路径中的天然组分，在优化步骤中使用纯化的重组Dicer裂解长dsRNA成特别的大小siRNA，已知可以有效地产生阻断反应。

我必须选择BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit产生的长dsRNA作为BLOCK-iT™ Dicer 的作用模板吗？
BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit是可以产生高质量、高产量dsRNA,是用来合成作为Dicer底物的dsRNA的理想试剂盒。其它来源的dsRNA效果也不错。

BLOCK-iT™ Dicer RNAi Transfection Kit和BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit配置如何？
Invitrogen公司试剂盒的配置为你提供进行RNAi实验所需要的一切。你只需要提供dsRNA底物，或者使用BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit（包含在BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit）产生你的dsRNA。
BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit提供对多达5个基因的在24孔板进行超过150次转染实验的足够的试剂，明显地比其它Dicer试剂盒提供更多次的转染实验。BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit提供：

· 高质量制备的BLOCK-iT™ Dicer酶
· 纯化d-siRNA的RNAi纯化试剂
· 在哺乳动物细胞中高效转染d-siRNA的Lipofectamine 2000

如果你希望使用真正最佳的invitrogen公司的试剂制备你的dsRNA底物，完成Dicer酶切反应，我们推荐使用BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit。这些试剂盒也包含一个易于使用的RNAi纯化模块和分离dsRNA(BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit)或者d-siRNA（BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit）的最佳程序。这些对于获得最佳结果至关重要。长dsRNA的纯度可能影响它作为底物进行Dicer酶切反应的效果。高效的ds-RNA的纯化是必要的，因为产品如果没有进行完全纯化来去除长dsRNA，可能会启动总的细胞关闭反应（general cell shutdown response）。我们的BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit包含了最卓越的siRNA转染试剂，Lipofectamine 2000，确保高效的转染和实验的成功。

有关定制RNA Oligos 的问题

Invitrogen公司的RNA寡核苷酸合成使用什么化学方法？
除了在核糖2羟基增加可一个保护基团外，RNA合成的化学方法与DNA合成的化学方法相同。这个位置通过甲硅烷基（silyl groups）保护，在整个合成过程中保持稳定。糖和碱基剩余的位置都使用与DNA相同的方式进行保护。

RNA寡核苷酸使用什么纯化方法？
RNA能够通过分析HPLC纯化。同时, 可以定制基本的脱盐纯化的RNA。我们不提供额外的双链退火后纯化。

脱盐和HPLC纯化的区别是什么？
HPLC纯化意味着oligo被纯化为全长，脱盐意味着从oligo中去除副产品。不涉及无效序列的纯化。

合成RNA寡核苷酸的最大长度是多少？
目前RNA寡核苷酸的最大长度是50碱基。

RNA寡核苷酸配对效率是多少？
98.5％

合成RNA寡核苷酸使用哪一种质量控制？
通过三苯基分析（trityl analysis）监测合成，通过质谱（mass spectroscopy）进行最终检验，以进一步确保质量。

提供合成RNA寡核苷酸的规模多大？我可以收到多大量的RNA？
提供合成规模是50nmol和200nmole。如果合成规模是0.2 mol，最终的产量并不是200nmole。保证产量为：单链RNA规格
规模脱盐HPLC50 nmole5 OD’s1 OD200 nmole20 OD’s3 OD’s规模脱盐HPLC50 nmole2 OD’s1 OD200 nmole8 OD’s3 OD’s
规模脱盐HPLC50 nmole20 nmole2 nmoles200 nmole80 nmole14 nmoles

收到何种形式的RNA寡核苷酸？
冻干（Lyophilized）。

如何确定已经RNA收到的量？
对于单链RNA，产品文件包括产品的质量、摩尔数和OD值。对于双链RNA，有标准发送产品量（参看规格）,并且被列在管上，COA仍将提供单链的详细情况。

RNA可以用来进行何种修饰？
5’磷酸，5’生物素， 5’荧光素注：只能得到脱盐的5’磷酸，5’生物素

能够获得在3’末端带有2个脱氧T的RNA寡核苷酸吗？
可以。只要简单地在要求序列中包括TT

如何贮存RNA寡核苷酸？
最好在-20℃或者以下以冻干形式贮存。

RNA的稳定性如何？
冻干形式的RNA可以在-20℃下贮存6个月

应该使用什么溶剂溶解RNA，水还是缓冲液？
推荐使用1xTE缓冲液（在无RNase的条件下配制 10 mM TrisCl, pH7.5, 0.1 mM EDTA）溶解单链RNA，这将缓冲pH和鳌合金属离子，减少RNA的降解。也可以使用无RNase水，双链的RNA冻干自10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA，再次悬浮在适量的水中，RNA浓度到20μm，将恢复到相同的缓冲液。

生物在线

喜欢作者我要约稿