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水环境中杀虫剂的分析

2020.3.04

草甘膦及相似极性杀虫剂的HPLC分析

采用液相色谱串联质谱建立了水环境中草甘膦、草氨膦在内的四种强极性农药的测定方法。样品直接过滤进样，在HILIC柱下得到良好的保留效果。质谱检测采用电喷雾负离子化模式和多反应检测模式。结果表明，四种化合物在1~500ng/mL范围内线性良好，线性相关系数在0.979~1.000之间。通过对空白水样进行加标，方法的平均回收率在95~110%范围内，四种化合物的方法检出限为0.5ng/mL。该方法快速，灵敏，适用于水中草甘膦、氨甲基膦酸、草氨膦以及乙烯利的测定。

草甘膦是一种广谱除草剂，广泛用于杀灭杂草，尤其是一年生阔叶类杂草和常见与作物竞争生长的杂草。通常来说草甘磷对非靶标生物是有一定毒性的，美国环保署(EPA)将草甘磷列为第三类有毒物质^[1]。然而草甘膦由土壤渗透进入地下水或者在水产养殖中用于去除池塘附近杂草，仍然是水环境中不可忽视的农药。但是由于草甘膦等化合物强极性，导致在传统反相色谱柱上难以保留，影响分析准确度，所以通常分析前需要与芴酰氯(FMOC-CL)反应，经FMOC衍生后被测试^[2]。但是衍生过程增加了分析的复杂程度，所以在一个方法中建立无需衍生的分析方法的需求逐渐增加，并且希望同时可以分析除草甘膦(Glyphosate)及其主要代谢产物氨甲基膦酸(AMPA)外，草铵膦(Glufosinate)及其相似的强极性化合物乙烯利(Ethephon)。文献报道草甘膦分析方法有气相色谱法^[3]、液相色谱法^[4]，以及液相色谱质谱联用法^[5]，其中以液相色谱质谱联用法最为常见。本研究中，水样过滤膜过滤直接进入LC-MS/MS分析，无需衍生的草甘膦及其相似极性的杀虫剂检测。实验中展示的原始数据建立在AB SCIEX公司LC-MS/MS平台上，利用HILIC色谱柱分离，通过空白水样添加标准溶液的方式模拟日常检测工作。

实验部分

仪器与试剂

液相系统采用岛津LC-20AXR，配两个岛津LC20AD液相泵，SIL20AC自动进样器，以及一个CTO20A柱温箱。AB SCIEX公司LC-MS/MS配Turbo V离子源。Millipore-Elix-QE-QG超纯水机(美国 Millipore 公司); CPA 225D 分析天平(德国Sartorius公司)等实验室常用设备。

草甘膦、AMPA、草铵膦、乙烯利标准品，购于Dr.Ehrenstorfer 公司;乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水;冰醋酸为分析纯;标准品用少量甲醇溶解，色谱纯甲醇定容配制1 mg/mL 标准储备液，再根据需要稀释成适当含量的标准工作液，4 ℃下保存，有效期为2 个月。

色谱条件

化合物在Obelisc N相HPLC色谱柱上分离，柱温50 ℃，进样量50 µl，流速1.2ml/min。流动相A相为酸化85%乙腈/水含醋酸胺溶液(乙腈/水:85/15)，B相为酸化含醋酸胺的水溶液。流动相梯度见表1。

表1.用于分离的流动相梯度

Step	Time	Flow(mL/min)	A(%)	B(%)
0	2	1.2	100	0
1	3	1.2	100	0
2	3.6	1.2	0	100
3	8	1.2	0	100
4	8	1.5	0	100
5	8.2	1.5	100	0
6	13.5	1.5	100	0
7	13.8	1.2	100	0
8	14	1.2	100	0

质谱条件

4种杀虫剂化合物分析方法在AB SCIEX QTRAP^®5500的LC-MS/MS系统上建立，配Turbo V^TM离子源电离化合物，负离子模式，喷雾电压IS为-4500V。其它离子源参数：气帘气35psi，喷雾气(Gas1)60psi，干燥气(Gas2)70psi，碰撞气(CAD)为medium，离子源温度650℃。MRM离子对及化合物保留时间列于表2，每个MRM离子对的驻留时间(dwell time)设置50ms。

表2.化合物LC-MS/MS参数

Compound	RT (min)	Q1 (amu)	Q3 (amu)	DP (V)	CE (eV)
AMPA	4.3	110	79	-60	-24
		110	63	-60	-26
Ethephon	7.4	143	79	-45	-26
		143	107	-45	-12
Glufosinate	6.0	180	63	-60	-66
		180	95	-60	-24
Glyphosate	6.8	168	79	-110	-54
		168	63	-110	-32

结果与讨论

图1展示一次进样采集浓度为10ng/mL标准溶液的色谱图，图中包含的4种杀虫剂的色谱图。每个化合物监测两个离子对，并且利用MRM离子对的比例对化合物进行定性确证。

图1.含量为10ng/mL标准溶液色谱图。

将标准溶液逐级稀释，当浓度为0.5ng/mL时四种化合物噪音的S/N均大于3，认定此时为这四种化合物的检出限。同理，当浓度为1ng/mL时四种化合物噪音的S/N均大于10，认定此时为这四种化合物的定量限。图2和表3中展示了目标杀虫剂的校正曲线以及在1-500ng/mL范围内线性回归，线性权重按1/X计算。经定量计算后，可以看到所有校正曲线上点的准确度在95-105%之间。

方法中不同化合物的灵敏度列于表3中。所有杀虫剂均能被识别并定量，满足欧盟国际标准化合物最大残留限量(MRL)要求。检测方法的灵敏度足够高，所以允许对提取溶液进行稀释以期望尽可能减少基质干扰。

表3.化合物离子对信息及1-500ng/mL测试范围内线性回归

Compound	MRM transition	Linearfit(r值)	S/N 1 ng/mL
AMPA	110/79	0.999	131
	110/63	0.999	234
Ethephon	143/79	0.979	58
	143/107	0.984	155
Glufosinate	180/63	1.000	88
	180/95	0.999	47
Glyphosate	168/79	0.999	52
	168/63	0.999	102

*浓度为1ng/mL标准溶液的信噪比(S/N*);S/N值由MultiQuant^TM软件自动计算

图2.极性杀虫剂浓度1-500ng/mL范围内校正曲线。

方法的验证使用标准添加到空白基质中来衡量。图3和图4展示4种不同极性杀虫剂，基质中添加标准的水平控制在100ng/mL时的色谱图。实验中使用污水、地表水、地下水以及饮用水等四种基质，针对不同基质分别进行测试。

图3 100ng/mL添加到地表水基质后色谱图。

图4.100ng/mL添加到污水基质后色谱图。

通过空白基质加标10ng/mL和100ng/mL两个水平，每个水平重复5次测试，得出结论方法不受基质效应影响，回收率在95%~110%之间。该方法重复性良好，可用于日常实验室监测分析水样本中四种强极性农药。由于实验室样本量大，分析数据多等问题，实验过程中使用MultiQuant^TM数据分析软件。软件可根据客户需要定义不同的条件，如设定筛选条件为MRM比例和标记出超过最大残留限量的样品时，当结果超过设定限量值，软件将该行标为红色以示警告。图5中展示数据采集后运行筛选条件，得到的定量结果和色谱峰。

图5.MultiQuant^TM软件自动报告杀虫剂运行筛选功能。

小结

本研究中清楚的展示了草甘膦及一些相似极性的杀虫剂分析方法，该方法可用于定量检测低水平的复杂基质样品，过程中无需衍生，仅需借助高灵敏度的LC-MS/MS 系统分析样品。这样对质谱的灵敏度要求比较高，本实验中采用AB SCIEX QTRAP^®5500高灵敏度质谱仪，利用新型HILIC 液相色谱柱分离。即使不是在最理想的酸性流动相条件下，即使流动相中水相比例非常高，即使流速超过1ml/min，由于使用TurboV^TM离子源超强雾化能力，能够实现快速分析这些化合物。这意味着将不再需要FMOC衍生或者超长的离子色谱分析方法分析草甘膦等强极性杀虫剂，采用本方法即可满足甚至超出分析要求。

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